曲文娟，馬海樂(lè)，賈俊強(qiáng)，潘忠禮

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013; 2.美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，美國(guó)戴維斯95616; 3.美國(guó)農(nóng)業(yè)部西部研究中心，美國(guó)伯克利94710)

米糟蛋白酶解制備生物肽及其抗氧化活性的研究

曲文娟1，馬海樂(lè)1，賈俊強(qiáng)1，潘忠禮2，3

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013; 2.美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，美國(guó)戴維斯95616; 3.美國(guó)農(nóng)業(yè)部西部研究中心，美國(guó)伯克利94710)

為了高值化利用米糟資源，以米糟蛋白為原料通過(guò)酶解法生產(chǎn)一種高效、低毒的天然米糟抗氧化肽。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:7種蛋白酶中，中性酶為最佳酶選，其最佳酶解條件為:米糟蛋白質(zhì)量濃度(S)為10g/100mL，中性酶濃度(E/S，質(zhì)量分?jǐn)?shù))為8%，pH為6.0，溫度為60℃，時(shí)間為30min。在該最佳酶解條件下，米糟生物肽的得率為18.50%，水解度為2.84%，DPPH·(1，2－二苯代苦味肼基自由基)清除率為90.10%。該米糟生物肽具有較強(qiáng)的DPPH和羥自由基清除能力，其IC50值(抗氧化活性為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的米糟生物肽質(zhì)量濃度)分別為1.136、0.169g/L，還具有較強(qiáng)的還原能力和Fe2+螯合能力(IC50值為2.127g/L)。由此得出，米糟蛋白是一種很好的米糟抗氧化肽生產(chǎn)原料，且該生物肽是一種較為理想的天然抗氧化劑產(chǎn)品。

米糟蛋白，抗氧化劑，酶解法，生物肽，抗氧化活性

自由基理論認(rèn)為，隨著年齡增長(zhǎng)或在某些病理狀態(tài)下以及機(jī)體受到創(chuàng)傷時(shí)，體內(nèi)抗氧化酶活性下降，人體在生理代謝過(guò)程中產(chǎn)生的含氧自由基不能及時(shí)清除，積累過(guò)多的自由基將與機(jī)體內(nèi)的一些生物大分子發(fā)生反應(yīng)生成大量氧化物或過(guò)氧化物可導(dǎo)致許多慢性病，如動(dòng)脈硬化癥［1］、關(guān)節(jié)炎、癌癥［2］及其它變性疾?。?］。因此，尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來(lái)研究者們關(guān)注的課題。天然抗氧化肽因具有高效清除自由基且安全性高的優(yōu)勢(shì)，引起了人們的廣泛關(guān)注。目前已有一些關(guān)于天然抗氧化肽的研究，如酪蛋白抗氧化肽、油茶餅粕抗氧化肽、花生抗氧化肽等，且研究主要集中在抗氧化肽的制備和活性方面［4－8］。國(guó)內(nèi)外也已有關(guān)于大米抗氧化肽的研究［9－12］，多是以大米作為生產(chǎn)原料，對(duì)大米淀粉加工后的副產(chǎn)物－米糟資源的高效利用較少，且主要側(cè)重于制備和功能性方面的研究，對(duì)其抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)的全面系統(tǒng)研究較少。我國(guó)的稻谷年產(chǎn)量為1.85億t，居世界首位，大米資源極其豐富。米糟作為大米淀粉加工后的主要副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量高達(dá)70%，但因其色澤和水溶性較差，主要被用作廉價(jià)動(dòng)物飼料或直接扔棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。因此，為了高值化利用米糟蛋白資源生產(chǎn)出一種高效、低毒的天然米糟抗氧化肽，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶篩選和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得了米糟生物肽的最佳酶解制備工藝條件。同時(shí)，通過(guò)多項(xiàng)抗氧化指標(biāo)(DPPH·清除率、·OH清除率、Fe2+螯合率和還原能力)系統(tǒng)表征了米糟生物肽的抗氧化活性。本文采用了酶解法制備米糟抗氧化肽，以期達(dá)到安全性高，生產(chǎn)條件溫和，可定位生產(chǎn)特定肽的目的，為米糟資源的有效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糟蛋白原料 純度為70%，嘉吉飼料鎮(zhèn)江有限公司;1，2－二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) Sigma公司;堿性酶和胰蛋白酶 Novozymes公司;風(fēng)味酶、中性酶、復(fù)合酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 無(wú)錫市雪梅酶制劑科技有限公司，7種蛋白酶的性能見(jiàn)表1;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

WFJ7200型分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;DZF－6020型真空干燥箱 深圳市愛(ài)特爾電子科技有限公司;SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;SHZ－88A型往復(fù)式水浴恒溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;LD5－2A型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;PHS－25A型數(shù)字pH計(jì) 上海大普儀器有限公司;SK－Ⅰ型快速混勻器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶篩選實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取米糟蛋白5g、酶0.25g，加水至100mL，在各酶最適酶解條件下水解2h，然后在100℃下滅酶20min，在3500r/min下離心，取上清液分別測(cè)定水解度、DPPH·清除率和IC50值。

表1 7種蛋白酶的最適酶解條件和酶活性Table 1 Optimum enzymolysis conditions and enzymatic activities of seven protease

1.2.2 工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，故將酶解時(shí)間固定為30min。選取米糟蛋白質(zhì)量濃度(S)、中性酶濃度(E/S，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酶解pH、酶解溫度為4個(gè)考察因素，對(duì)每個(gè)因素選取4個(gè)水平，進(jìn)行L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2和表3，以DPPH·清除率為考察指標(biāo)，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 分析實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 水解度的測(cè)定 水解度(degreeof hydrolysis，DH)是按文獻(xiàn)［13］的方法測(cè)定得。水解度即米糟蛋白酶解過(guò)程中，水解的肽鍵數(shù)與總肽鍵數(shù)之間的比值，用以表征米糟蛋白水解的程度。水解度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)的計(jì)算公式如下:

式中:DH－水解度，%;W1－米糟生物肽中游離氨基氮含量(采用pH－stat法測(cè)定)，g/mL;W2－米糟蛋白質(zhì)量濃度，g/mL;5.93－米糟蛋白的換算系數(shù)。

1.2.3.2 DPPH·清除率的測(cè)定 對(duì)文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，移取2mL米糟生物肽溶液置于試管中，加入2mL 0.04g/L的DPPH乙醇溶液，混合均勻，在室溫下反應(yīng)20min，3500r/min離心10min，取上清液在517nm處測(cè)吸光值為Ai(樣品組的吸光值);另各取2mL上述濃度的米糟生物肽溶液置于試管中，再加入2mL無(wú)水乙醇，混合均勻，在室溫下反應(yīng)20min，3500r/min離心10min，取上清液在517nm處測(cè)吸光值記為Aj(空白組的吸光值);以2mL雙蒸水和2mL 0.04g/L DPPH乙醇溶液作為對(duì)照，其吸光值記為Ah(對(duì)照組的吸光值)。以維生素C作為對(duì)照樣品。DPPH·清除率(%)的計(jì)算公式如下:

1.2.3.3 羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定 對(duì)文獻(xiàn)［15］的方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，移取2mL米糟生物肽溶液置于試管中，依次加入2mL 6mmol/L的硫酸亞鐵溶液(FeSO4)、2mL 6mmol/L的雙氧水溶液(H2O2)，混合均勻，在室溫下反應(yīng)10min，再加入2mL 6mmol/ L水楊酸溶液，混合均勻，在室溫下反應(yīng)30min，取上清液在510nm處測(cè)其吸光值記為Ae(樣品組的吸光值);當(dāng)用雙蒸水代替水楊酸溶液時(shí)測(cè)得的吸光值記為Af(空白組的吸光值);對(duì)照組以雙蒸水代替米糟生物肽溶液測(cè)得的吸光值記為Ad(對(duì)照組的吸光值)。以維生素C作為對(duì)照樣品。羥自由基清除率(%)的計(jì)算公式如下:

1.2.3.4 Fe2+螯合率的測(cè)定 對(duì)文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，移取1mL米糟生物肽溶液置于試管中，依次加入3.7mL去離子水、0.1mL 2mmol/L氯化亞鐵溶液(FeCl2)、3.7mL 5mmol/L亞鐵嗪溶液(Ferrozine)，混合均勻，在室溫下反應(yīng)10min，取上清液在562nm處測(cè)其吸光值記為Aa(樣品組的吸光值);對(duì)照組以去離子水代替米糟生物肽溶液測(cè)得的吸光值記為Ab(對(duì)照組的吸光值)。以乙二胺四醋酸(EDTA)作為對(duì)照樣品。Fe2+螯合率(%)的計(jì)算公式如下:

1.2.3.5 還原能力的測(cè)定 還原能力是按文獻(xiàn)［17］的方法測(cè)定。吸光值越高，代表米糟生物肽的還原能力越強(qiáng)。同時(shí)以維生素C作為對(duì)照樣品。

1.2.3.6 IC50值的測(cè)定 IC50值(半抑制濃度)代表抗氧化活性為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的米糟生物肽質(zhì)量濃度(g/L)。配制不同濃度的米糟生物肽溶液，測(cè)定其各自的抗氧化活性，得出米糟生物肽濃度與抗氧化活性的關(guān)系方程，從而計(jì)算抗氧化活性為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的米糟生物肽質(zhì)量濃度即為IC50值。IC50值越低，表明米糟生物肽的抗氧化活性越強(qiáng)。

所有樣品均取三個(gè)平行樣進(jìn)行分析測(cè)試，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均記錄其平均值。采用Excel軟件對(duì)DPPH·清除率進(jìn)行Anova分析用來(lái)判斷數(shù)據(jù)之間是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本文對(duì)7種常用蛋白酶對(duì)米糟蛋白的酶解效果分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率、水解度和IC50值Fig.1 DPPH·scavenging rate，degree of hydrolysis and IC50value of each hydrolysate

從圖1可以看出，米糟蛋白(濃度為5g/100mL)經(jīng)7種蛋白酶水解制備的米糟生物肽均具有一定的DPPH·清除效果。這是因?yàn)槊自愕鞍妆坏鞍酌笍氐姿獬尚》肿恿科蔚亩嚯?1000～5000u)，該多肽含有大量的末端疏水性氨基酸［18］，如Trp、Tyr、Phe和Pro，經(jīng)之前研究證實(shí)該多肽具有抗氧化的功效［19］。因此可以說(shuō)明米糟蛋白經(jīng)蛋白酶水解制備的米糟生物肽具有抗氧化活性，可以高效清除DPPH·。

從圖1還發(fā)現(xiàn)，米糟蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解所得的生物肽具有最高的水解度，米糟蛋白經(jīng)中性酶水解所得的生物肽對(duì)DPPH·的清除率最高，米糟蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解所得的生物肽具有最低的IC50值。綜合考慮水解度、DPPH·清除率和IC50值評(píng)價(jià)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)中性酶水解制備的米糟生物肽具有較優(yōu)的水解度、DPPH·清除率和IC50值，故將中性酶作為最佳酶選，用于下一步的米糟蛋白酶解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中各米糟生物肽的DPPH·清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of orthograpbic experiment

從表3的極差分析結(jié)果可以看出，因素主次順序?yàn)?A＞D＞B＞C，最優(yōu)方案為A4B4C2D2。由此得出:米糟蛋白質(zhì)量濃度對(duì)米糟生物肽的DPPH·清除率影響最大，其次是酶解溫度、中性酶濃度、酶解pH。同時(shí)獲得了米糟生物肽的最佳酶解制備條件為:米糟蛋白質(zhì)量濃度(S)為10g/100mL，中性酶濃度(E/S，質(zhì)量分?jǐn)?shù))為8%，pH為6.0，溫度為60℃，時(shí)間為30min。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表4所示。

從表4中發(fā)現(xiàn)，米糟蛋白質(zhì)量濃度和酶解溫度因素對(duì)結(jié)果影響很顯著，而中性酶濃度和酶解pH對(duì)結(jié)果影響不顯著(顯著性考察水平為0.05)，方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。由于最優(yōu)方案并未出現(xiàn)在正交表中，所以對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明米糟生物肽產(chǎn)品的DPPH·清除能力重現(xiàn)性良好。同時(shí)在該最佳條件下，米糟生物肽的得率為18.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，水解度為2.84%，DPPH·清除率為90.10%。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis of orthogonal experiment

2.3 米糟生物肽抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 米糟生物肽清除DPPH·的效果分析 DPPH·是一種對(duì)人體有害的自由基。因此目前以DPPH·清除率作為評(píng)價(jià)物質(zhì)是否具有抗氧化活性的指標(biāo)之一［14］。本文對(duì)米糟生物肽和維生素 C(對(duì)照)的DPPH·清除能力分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 米糟生物肽(a)和維生素C(b)的DPPH·清除率Fig.2 Scavenging rate of rice dreg peptide(a) and vitamin C(b)on DPPH radical

從圖2可以看出，隨著米糟生物肽和維生素C濃度的增大，其對(duì)DPPH·的清除率均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)它們各自濃度與DPPH·清除率之間進(jìn)行擬合，得到各自的回歸方程，由此計(jì)算得到米糟生物肽的 IC50值為 1.136g/L，維生素 C的 IC50值為0.005g/L，且米糟生物肽的 IC50值約為維生素 C的214倍。

2.3.2 米糟生物肽清除羥自由基的效果分析 對(duì)米糟生物肽和維生素C(對(duì)照)的羥自由基清除能力分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，米糟生物肽和維生素C濃度的增加均對(duì)羥自由基清除率起促進(jìn)作用。通過(guò)軟件擬合濃度與羥自由基清除率之間的關(guān)系，得到各自的回歸方程。結(jié)果得到:米糟生物肽的 IC50值為0.169g/L，維生素C的IC50值為0.086g/L，米糟生物肽的IC50值約為維生素C的1.96倍。

圖3 米糟生物肽(a)和維生素C(b)的羥自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of rice dreg peptide(a) and vitamin C(b)on hydroxyl radical

2.3.3 米糟生物肽對(duì)Fe2+螯合能力的效果分析

Fe2+離子可以通過(guò)Fenton反應(yīng)分解過(guò)氧化物產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致人類(lèi)產(chǎn)生一些心血管疾病。同時(shí)，F(xiàn)e2+還被認(rèn)為是產(chǎn)生氧自由基和促進(jìn)油脂過(guò)氧化的主要原因之一［20］。本文對(duì)米糟生物肽和EDTA(對(duì)照)的Fe2+螯合能力分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 米糟生物肽(a)和EDTA(b)的Fe2+螯合率Fig.4 Chelation rate of rice dreg peptide(a) and EDTA(b)on Fe2+

由圖4可見(jiàn)，隨著米糟生物肽和EDTA濃度的增加，其對(duì)Fe2+螯合能力均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。由此得出，米糟生物肽可以降低Fe2+的濃度，從而預(yù)防氧化損傷。通過(guò)軟件擬合濃度與Fe2+螯合率之間的關(guān)系，得到各自的回歸方程。結(jié)果得出:米糟生物肽的IC50值為2.127g/L，EDTA的IC50值為0.034g/L，米糟生物肽IC50值約為EDTA的62.9倍。

2.3.4 米糟生物肽還原能力的效果分析 對(duì)米糟生物肽和維生素C(對(duì)照)的還原能力分別進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 米糟生物肽和維生素C的還原能力Fig.5 Reduction ability of rice dreg peptide and vitamin C

在還原能力分析中得知:樣品在700nm處的吸光值越大，代表樣品的還原能力越大［17］。因此，我們得出:隨著米糟生物肽濃度的增大，其還原能力也進(jìn)一步增大;維生素C與米糟生物肽表現(xiàn)出相似的規(guī)律，但是增加速率較其快。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)酶篩選和酶解工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)米糟蛋白酶解制備米糟生物肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:中性酶為最佳酶選，其最佳酶解條件為:米糟蛋白質(zhì)量濃度(S)為10g/100mL，中性酶濃度(E/S，質(zhì)量分?jǐn)?shù))為8%，pH為6.0，溫度為60℃，時(shí)間為30min。在該最佳酶解條件下，米糟生物肽的得率為18.50%，水解度為 2.84%，DPPH· 清除率為90.10%。由此得出:米糟蛋白是一種很好的米糟生物肽生產(chǎn)原料。采用上述酶解工藝條件以米糟蛋白為原料制備米糟生物肽，經(jīng)實(shí)踐擴(kuò)大量工藝生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品品質(zhì)重現(xiàn)性良好，應(yīng)用經(jīng)濟(jì)性也較好。

3.2 對(duì)米糟生物肽的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明:米糟生物肽具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，其IC50值為1.136g/L;米糟生物肽具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力，其IC50值為0.169g/L;米糟生物肽對(duì)Fe2+離子具有較強(qiáng)的螯合作用，其IC50值為2.127g/L;米糟生物肽也表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力。由此得出:米糟生物肽具有一定程度的抗氧化活性，且具有低毒的優(yōu)勢(shì)，是一種較為理想的天然抗氧化劑產(chǎn)品，可以用作人工合成抗氧化劑的替代品。

3.3 與維生素C和EDTA對(duì)照相比，米糟生物肽的抗氧化活性相對(duì)較弱，考慮到米糟生物肽的純度對(duì)其抗氧化活性影響很大，因此非常有必要對(duì)米糟抗氧化肽進(jìn)一步純化。同時(shí)，對(duì)米糟生物肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，建立其結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系，進(jìn)一步提高其抗氧化活性，以期生產(chǎn)出高效的米糟抗氧化肽產(chǎn)品。

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Study on biological peptide preparation from rice dreg protein by enzymatic hydrolysis and its antioxidative activity

QU Wen－juan1，MA Hai－le1，JIA Jun－qiang1，PAN Zhong－li2，3
(1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China; 2.Department of Biological and Agricultural Engineering，University of California，Davis 95616，America; 3.United States Department of Agriculture West Regional Center，Berkeley 94710，America)

In order to high－valued utilize the rice dreg resources，a natural antioxidative peptide with high effective and low toxic properties was produced from rice dreg protein by the enzymatic hydrolysis method.The results showed that the neutral enzyme was optimum among seven protease.The optimum enzymatic hydrolysis conditions were 10g/100mL rice dreg protein concentration(S)，8%neutral enzyme concentration(E/S，w/w)，pH 6.0，temperature of 60℃and time of 30min.Under the optimum condition，rice dreg biological peptide had the yield of 18.50%，degree of hydrolysis of 2.84%and DPPH· scavenging rate of 90.10%.The results also showed that rice dreg biological peptide had strong scavenging capabilities on DPPH·and hydroxyl free radicals with IC50values of 1.136 and 0.169g/L.Moreover，the rice dreg biological peptide had strong reducing capability and chelating Fe2+ability with IC50value of 2.127g/L.It was concluded that rice dreg protein was a good source for producing antioxidative peptide and the rice dreg biological peptide was an ideally natural antioxidants.

rice dreg protein;antioxidants;enzymatic hydrolysis;biological peptide;antioxidative activity

TS210.9

A

1002－0306(2012)08－0183－06

2011－07－26

曲文娟(1980－)，女，博士，講師，研究方向:功能食品。

江蘇大學(xué)高級(jí)技術(shù)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(10JDG121);江蘇大學(xué)博士后基金項(xiàng)目(1143002027);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD);科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2009DFA32000)。