李姿瑾，紀(jì)麗蓮

(1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225127;2.淮陰師范學(xué)院，江蘇淮安223300)

不同提取方法的野馬追提取物抗氧化作用的比較研究

李姿瑾1，2，紀(jì)麗蓮2

(1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225127;2.淮陰師范學(xué)院，江蘇淮安223300)

以野馬追干制品為原料，利用6種不同的提取方法得到粗提物，分別利用FRAP法、ABTS法、超氧陰離子自由基清除法、總還原力法、羥自由基清除法、抗脂質(zhì)體過氧化法對抗氧化活性進(jìn)行測定比較，其中以BHT和BHA為陽性對照。除抗脂質(zhì)體過氧化活性以外，6種提取方法得到的粗提物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，但不同方法粗提物的具體抗氧化活性指標(biāo)差異顯著。水煎物清除羥自由基的作用最明顯，清除率為96.97%(P＜0.05)。70%乙醇回流法提取物對超氧陰離子自由基的清除作用最明顯，清除率高達(dá)87.70%(P＜0.05)。渣提物的總還原能力最強(qiáng)(P＜0.05)。六種提取物都具有高于BHT和BHA的ABTS+·清除能力，其中70%乙醇回流法和浸提法粗提物無顯著性差異。

野馬追，抗氧化，提取物

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RE－3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D型循環(huán)式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;WH－3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;UV757CRT型紫外可見分光光度計(jì)上海精科;電子天平 賽多利斯(北京)有限公司; DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH－8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 野馬追提取物的制備 Ⅰ:稱取野馬追干品150g，分三次加入70%乙醇，70℃恒溫回流，每次2h，提取液濃縮干燥后備用。Ⅱ:稱取野馬追干品130g，分三次加入甲醇，60℃恒溫回流，每次2h，提取液濃縮干燥后備用。Ⅲ:稱取野馬追干品750g，分三次加入90%乙醇浸提，每次90%乙醇體積約為3500mL，每次室溫下浸提48h，提取液減壓抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥處理后備用。Ⅳ:稱取野馬追干品750g，分三次加入70%乙醇浸提，每次室溫下浸提48h，提取液減壓抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，干燥處理后備用。Ⅴ:稱取野馬追干品350g，分三次加水煎煮，提取液過濾濃縮后，凍干備用。Ⅵ:90%乙醇浸提后的濾渣烘干后稱取350g分三次加水煎煮，水煎液過濾濃縮后，凍干備用。

其中:Ⅰ代表70%乙醇回流法提取物，Ⅱ代表甲醇提取物，Ⅲ代表90%乙醇提取物，Ⅳ代表70%乙醇浸提物，Ⅴ代表水煎物，Ⅵ代表渣提物。

1.2.2 提取物抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 清除羥自由基能力的測定 采用Fenton［10］法進(jìn)行，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物確定野馬追提取液對·OH的清除率。待測樣品重復(fù)測定三次，取三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值(以下每種測定方法均測定三次待測樣品，取均值)，同時(shí)扣除底物野馬追對吸光值的影響。

式中:A0為空白管的吸光值，A為樣品管的吸光值，A底為野馬追本身的吸光值。

1.2.2.2 ABTS法 根據(jù) Re［11］等的方法，向2.9mL ABTS試劑中加入0.1mL不同提取法提取的5mg/mL的樣品液，室溫放置10min，在734nm下測定吸光值A(chǔ)。同時(shí)測定2.9mL ABTS試劑與0.1mL吐溫－80混合液的吸光值A(chǔ)0。

ABTS試劑的配制:用蒸餾水配制14mmol/L的ABTS溶液，用蒸餾水配制4.9mmol/L的高硫酸鉀溶液，分別將ABTS和高硫酸鉀溶液按1∶1體積比混合過夜，臨用前用乙醇稀釋混合液，稀釋終點(diǎn)用混合液的吸光值來判斷，當(dāng)吸光值為 A734nm為 0.700± 0.020［12］時(shí)即可。

胡適認(rèn)為生命的意義“在于自己怎樣生活”，若能堅(jiān)定地“用此生作點(diǎn)有意義的事”，“活一日便有一日的意義，作一事便添一事的意義，生命無窮，生命的意義也無窮了”[注]胡適：《人生有何意義》，胡適著、歐陽哲生編：《胡適文集》第4冊，北京：北京大學(xué)出版社，2013年，第571頁。 。時(shí)間造就生命。他呼吁“無量平常人”要積極參與歷史進(jìn)程，倡導(dǎo)“健全的個(gè)人主義”，即作為生命個(gè)體存在的“我”不僅要做“進(jìn)化”洪流中圖存的“適者”，更要負(fù)責(zé)任地創(chuàng)造無窮時(shí)空中的“不朽”；不僅要有時(shí)間急迫感，追求“經(jīng)濟(jì)”的時(shí)間，更要自主地駕馭“閑暇”時(shí)間，充分發(fā)展自我，實(shí)現(xiàn)個(gè)性。胡適對“個(gè)人”的大力弘揚(yáng)，也標(biāo)志著個(gè)體時(shí)間意識的覺醒。

1.2.2.3 清除超氧陰離子自由基［13］采用Marklund法，利用鄰苯三酚自氧化體系測定野馬追提取物對超氧陰離子自由基的清除作用。

具體方法為:Tris－HCl緩沖液(pH 8.2，0.05mol/L)置于25℃水浴中預(yù)熱20min，在10mL離心管中分別加入4.5mL Tris－HCl緩沖溶液，加入0.1mL樣品、0.4mL鄰苯三酚溶液(2.5mmol/L)，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入1mL HCl(0.8mmol/L)終止反應(yīng)，于299nm處測定吸光度A，空白對照組以相同體積吐溫－80溶液代替樣品。

1.2.2.4 還原能力［14］實(shí)驗(yàn)原理:當(dāng)體系中存在還原性物質(zhì)時(shí)，鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng)，生成普魯士藍(lán)，在波長700nm處有最大吸收峰。故吸光度值越大，則提取液的還原能力越強(qiáng)［15］。

分別將1mL各提取液與2.5mL磷酸緩沖溶液(0.2mol/L，pH6.6)混合，再加入1%鐵氰化鉀2.5mL混合物于50℃恒溫20min后用流水迅速冷卻，再加1mL 10%三氯乙酸，然后3000r/min離心分離10min取上層清液2.5mL加入蒸餾水2.5mL和0.1%FeCl30.5mL混合均勻反應(yīng)10min在700nm處測定吸光度，吸光度越高，說明這種反應(yīng)混合物的還原性越強(qiáng)。

1.2.2.5 脂質(zhì)體抗氧化活性的測定［16］脂質(zhì)體的制備:脂質(zhì)體PBS分散系(LLS)900mg卵磷脂溶解于90mL、50mmol/L、pH7.4的PBS中，冰水浴超聲2h。

于離心管中加入1.5mL的LLS，分別加入不同提取液300μL、1mmol/L的FeCl3600μL、1mmol/L抗壞血酸 600μL，在 37℃水浴 1h后加入 1.5mL TCA (20%)、1.5mL TBA(1%)沸水浴15min，在532nm測吸光值。

抑制率IC(%)=［A0－(A－A底)］/A0×100% 1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的數(shù)據(jù)都經(jīng)過SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD(P＜0.05)法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野馬追對羥自由基的清除作用

從圖1可知，野馬追70%乙醇浸提物、水煎物、渣提物均有清除羥自由基的能力，其清除率分別為33.84%、96.97%、54.93%，大于陽性對照 BHT和BHA的23.82%，其中水煎法的野馬追提取物清除羥自由基的能力最強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明其清除率與其他提取方法有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 野馬追不同提取方法提取物對羥自由基的清除作用Fig.1 Different extraction methods of Eupatorium lindleyanum DC.extract on scavenging·OH

2.2 野馬追對ABTS+自由基的清除作用

由圖2可得，各種野馬追的提取物均有清除ABTS+·的作用，并且自由基的清除率都在60%以上，但不同的提取方法之間其清除作用有差異，70%乙醇回流法提取物(99.2%)＞70%乙醇浸提物(98.29%)＞水煎物(93.41%)＞渣提物(91.40%)＞90%乙醇提取物(82.71%)＞甲醇提取物(66.20%)＞BHA(1.43%)＞BHT(1.15%)，其中，70%乙醇回流法提取物對ABTS+·的清除作用最強(qiáng)。70%乙醇回流法和70%乙醇浸提法無顯著性差異，水煎法和渣提法得到的提取物對ABTS+·的清除作用也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 野馬追不同提取方法提取物對ABTS+·的清除作用Fig.2 Different methods of Eupatorium lindleyanum DC.extract on scavenging ABTS+·

2.3 野馬追對超氧陰離子自由基的清除作用

從圖3可得，70%乙醇回流法提取物對超氧陰離子自由基的清除作用最明顯，清除率高達(dá)87.70%，且與其他提取方法所得的提取物有顯著差異(P＜0.05)。甲醇提取物、90%乙醇提取物、70%乙醇浸提物、水煎物、渣提物的清除率分別為13.39%、54.39%、10.54%、13.47%、5.77%，統(tǒng)計(jì)分析可知:甲醇提取物、70%乙醇浸提物和水煎物對超養(yǎng)陰離子的清除作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而BHT和BHA的清除率分別為24.20%和6.78%。

圖3 野馬追不同提取方法提取物對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Different methods of Eupatorium lindleyanum DC. extract on scavenging O2－·

2.4 野馬追總還原力測定

當(dāng)鐵氰化鉀被野馬追還原成亞鐵氰化鉀，在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng)，生成普魯士藍(lán)，波長700nm處有最大吸收峰，故吸光值越大，野馬追提取液的還原能力越強(qiáng)。由圖4得，各提取物還原力由強(qiáng)到弱的順序是渣提物(1.92)＞70%乙醇回流法提取物(1.07)＞70%乙醇浸提物(1.00)＞90%乙醇提取物(0.98)＞甲醇提取物(0.83)＞水煎物(0.70)，各種提取物的還原力均優(yōu)于BHT(0.02)和BHA (0.03)。渣提物的總還原力顯著高于其他提取物，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 野馬追不同提取方法提取物總還原力測定Fig.4 Different extraction methods of Eupatorium lindleyanum DC.extract for determination of total reducing

2.5 野馬追抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

由圖5知，野馬追70%乙醇回流法提取物、甲醇提取物、90%乙醇提取物、70%乙醇浸提物均對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有抑制作用，其抑制率分別為23.14%、26.26%、23.62%和 8.00%，其抑制作用低于 BHT (61.09%)和BHA(49.32%)。

圖5 野馬追不同提取方法提取物抗脂質(zhì)過氧化能力的測定Fig.5 Different extraction methods of Eupatorium lindleyanum DC. extract determination of lipid peroxidation capacity

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對不同提取方法的野馬追提取物進(jìn)行了抗氧化活性的研究，以羥基自由基清除率、ABTS法、超氧陰離子自由基清除率、總還原能力法、脂質(zhì)體抗氧化活性的測定模型測定了各提取物的抗氧化能力，見表1。

結(jié)果表明:野馬追的70%乙醇浸提物、水煎物和渣提物均有清除羥自由基的能力，清除率明顯強(qiáng)于BHT和BHA，其中水煎物的清除作用最為明顯，清除率高達(dá)96.97%，顯著高于其他提取物(P＜0.05)。六種提取物都具有較強(qiáng)清除ABTS+·的能力，清除率明顯高于BHT和BHA，70%乙醇回流法提取物清除率達(dá)99.2%，70%乙醇浸提物清除率為98.29%，二者無顯著性差異。野馬追70%乙醇回流法提取物清除超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)于其余五種提取物和BHT、BHA，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同提取物總還原力由強(qiáng)到弱的順序是:渣提物＞70%乙醇回流法提取物＞70%乙醇浸提物＞90%乙醇提取物＞甲醇提取物＞水煎物，渣提物的總還原能力顯著高于其他幾種提取物，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。野馬追的各提取物抗脂質(zhì)體過氧化的作用都不明顯。

表1 不同提取方法提取物的抗氧化能力Table 1 Effect of different extracting methods antioxidant capacity

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Comparative study on the antioxidant activity of different kind of extracts from Eupatorium lindleyanum DC.

LI Zi－jin1，2，JI Li－lian2
(1.Yangzhou Univerity，Yangzhou 225127，China;2.Huaiyin Normal Univerity，Huaian 223300，China)

Extracts obtained by six different extraction methods from Eupatorium lindleyanum DC.were detected the antioxidant activity by the FRAP method，ABTS method，superoxide anion radical scavenging method，the total reducing power method，hydroxyl free radical scavenging method and antilipid peroxidation method，and the antioxidants BHT and BHA were used as positive controls.The results showed that，except the antilipid peroxidation activity，other activities of the extracts were of high－performance specific with its different methods.The clearance rate of the water decoction extract for hydroxyl radical scavenging activity was 96.97%，which was significantly higher than other extractions(P＜0.05).The superoxide anion scavenging effect of the 70%alcohol reflux extract was obviously stronger than other extractions，which the scavenging rate was 87.70%，and the difference with other extracts had statistical significance(P＜0.05).The reducing ability of the residue water extract was the strongest (P＜0.05)in the six extracts.All the six extracts had a strong ability to remove ABTS+·，which the clearance rates were higher than BHT and BHA，there was no significant difference in the clearance rate between the 70%alcohol reflux extract and the 70%ethanol extract.

Eupatorium lindleyanum DC.;antioxidant;extract

TS201.1

A

1002－0306(2012)08－0164－04

野馬追(Eupatorium lindleyanum DC.)是菊科植物輪葉澤蘭的全草，中醫(yī)藥理認(rèn)為本品苦、平，具有清熱解毒、祛痰、定喘、降血壓和提高人體免疫力等功效，主要用于治療慢性氣管炎、支氣管炎、高血壓等疾?。?－2］。目前，野馬追的活性研究主要集中在降血脂、降膽固醇［3－5］、止咳、平喘、化痰［6］、急性肺損傷等方面［7－9］，對于抗氧化作用的研究鮮有報(bào)道。近年來隨著食品安全問題的不斷出現(xiàn)，崇尚自然、健康食品的理念已越來越被大眾所接受，所以開發(fā)天然高效、安全無毒、性能穩(wěn)定的天然防腐劑成為食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在用得最廣泛的叔丁基羥基茴香醚(BHA)、二叔丁基羥基甲酚(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、三羥基苯丁酮(THBP)等，都因存在安全問題或性能上的缺陷而在使用上受到限制，所以研究野馬追的抗氧化活性，可以為開發(fā)天然、高效、安全的食品防腐劑提供依據(jù)。

2011－07－08

李姿瑾(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:營養(yǎng)生化方向。