孫鐘雷，萬 鵬

(1.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶408100; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，湖北武漢430070)

顯微圖像處理技術(shù)快速檢測酵母菌總數(shù)

孫鐘雷1，萬 鵬2，*

(1.長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶408100; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，湖北武漢430070)

采用顯微圖像處理技術(shù)快速檢測酵母菌的數(shù)目。將生物顯微鏡、CCD攝像頭、圖像采集卡、計算機等組成硬件部分，利用Visual C++6.0軟件編制酵母菌自動計數(shù)軟件部分，最終形成酵母菌總數(shù)檢測系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)對啤酒酵母裝片進行圖像采集、圖像預(yù)處理、閾值分割、圖像增強、形態(tài)學(xué)處理，最后采用連通判別法和形狀因子相結(jié)合進行酵母菌識別和數(shù)目統(tǒng)計。經(jīng)顯微鏡直接計數(shù)法驗證，結(jié)果表明此方法的平均相對誤差為2.56%，對單個裝片的檢測時間不超過8s。顯微圖像處理技術(shù)簡便快速、檢測準(zhǔn)確，可以用于酵母菌總數(shù)的檢測，克服了傳統(tǒng)微生物計數(shù)的不足。

酵母菌，微生物計數(shù)，顯微圖像處理，快速檢測

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

啤酒酵母菌 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;鉻酸 分析純，重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠。

303－3恒溫培養(yǎng)箱 江蘇省車臺電器廠;SW－CJ－2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZDX－35BI蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;細口滴管、血球計數(shù)板、接種環(huán)、玻片等 成都科龍化玻廠; B104LED生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;DXC－390P 3 CCD型彩色攝像頭 日本SONY公司;Matrox MeteorⅡ圖像采集卡 加拿大Matrox公司;計算機 IBM公司。

1.2 酵母菌總數(shù)檢測系統(tǒng)

酵母菌總數(shù)檢測系統(tǒng)主要包括硬件和軟件兩部分。硬件部分:B104LED生物顯微鏡，DXC－390P 3 CCD型彩色攝像頭，Matrox MeteorⅡ圖像采集卡，計算機。軟件部分:應(yīng)用Microsoft Visual C++6.0自行開發(fā)的酵母菌自動計數(shù)系統(tǒng)和控制系統(tǒng)。

1.3 酵母菌的前處理

將啤酒酵母菌在無菌條件下接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，然后制成酵母菌懸液。采用鉻酸洗液對載玻片和蓋玻片進行處理，在無菌條件下取酵母菌懸液的稀釋液，在載玻片上涂成均勻的薄薄的一層，蓋上蓋玻片，制成裝片待用。

1.4 酵母菌總數(shù)檢測方法

先將酵母菌總數(shù)檢測系統(tǒng)安裝調(diào)試完畢，把處理好的裝片置于生物顯微鏡上，調(diào)好焦距，打開酵母菌自動計數(shù)系統(tǒng)界面。點擊“圖片處理”菜單，使用“圖像采集”子菜單采集到酵母菌圖片，然后使用“去除噪聲”、“灰度處理”等命令進行圖片預(yù)處理，再使用“圖像分割”、“圖像增強”、“形態(tài)學(xué)處理”等命令對圖片進一步處理，最后點擊“酵母菌計數(shù)”菜單，自動統(tǒng)計圖片中酵母菌數(shù)目。

1.5 酵母菌總數(shù)的驗證方法

采用顯微鏡直接計數(shù)法［1］對酵母菌總數(shù)進行驗證。用無菌的細口滴管取酵母菌懸液的稀釋液，滴入血球計數(shù)板，并置于顯微鏡載物臺，進行鏡檢、人工統(tǒng)計數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微圖像處理

2.1.1 圖像預(yù)處理 由于生物顯微鏡電源本身的干擾噪聲、光照度不均勻等問題都會影響到圖片采集的效果，以至于影響酵母菌的計數(shù)，采用中值濾波和線性灰度變換法對酵母菌圖片進行預(yù)處理，結(jié)果如圖1。

圖1 酵母菌圖像預(yù)處理比較Fig.1 Contrast of the yeast’s preprocessing image

圖1(a)為未經(jīng)處理的圖像，帶有很大的噪聲，圖像很不清晰;圖1(b)為處理后的圖像，圖片背景中的暗紋幾乎被清除，大部分噪聲被去掉，得到了較清晰的圖片，采用灰度處理后將原圖轉(zhuǎn)化為灰度圖以便下一步的圖像分割。

2.1.2 圖像分割 采用直方圖閾值法進行圖像分割。利用Visual C++6.0軟件，在Dialog中完成直方圖對話框的設(shè)計，在“圖片處理”的子菜單中添加“圖像分割”菜單，然后在其按鈕中添加“ONTXFG”類創(chuàng)建程序，直方圖如圖2所示。由圖2可以看出，直方圖中有明顯的波峰和波谷，說明物體和背景之間的灰度級有明顯的差別，此法可行。根據(jù)直方圖對話框選擇波峰和波谷確定其閾值，其中紅色閾值區(qū)間為77～100，綠色閾值區(qū)間為76～97，藍色閾值區(qū)間為74～100。利用直方圖閾值進行圖像分割，得到二值圖像，如圖3所示。

圖2 酵母菌直方圖對話框Fig.2 Dialog box of the yeast’s image histogram

圖3 酵母菌圖像分割處理比較Fig.3 Contrast of the yeast’s image segmentation

2.1.3 圖像增強 由于圖像分割后得到的酵母菌二值圖像有很多噪聲干擾和雜質(zhì)點，采用自適應(yīng)平滑法對圖像進一步增強處理。在“圖片處理”的子菜單中添加“圖像增強”菜單，然后在其按鈕中添加“ONTXZQ”類創(chuàng)建程序，處理結(jié)果如圖4所示。

圖4 酵母菌圖片的圖像增強處理比較Fig.4 Contrast of the yeast’s image enhancement

從圖4中可以看出，酵母菌圖片經(jīng)過增強處理后，圖片背景中的雜質(zhì)點大部分被去除，得到的酵母菌圖片效果清晰，并且保留了一定的邊緣信息，此法有助于提高酵母菌計數(shù)的精確性。

2.1.4 形態(tài)學(xué)處理 由于增強處理后的酵母菌圖像邊緣有毛刺、內(nèi)部有空洞，選用形態(tài)學(xué)中腐蝕和膨脹運算進行處理。圖像腐蝕的作用是清除物體邊界點，使邊界向內(nèi)部收縮的過程，可以把小于結(jié)構(gòu)元素的物體去除，而圖像膨脹的作用與腐蝕的作用正好相反，它是對二值化物體邊界點進行擴充，將與物體接觸的所有背景點合并到該物體中，使邊界向外部擴張的過程。在“圖片處理”的子菜單中添加“圖像形態(tài)學(xué)處理”按鈕，然后在其按鈕中添加“ONTXXINGTXCL”類，創(chuàng)建程序，處理結(jié)果如圖5所示。

圖5 酵母菌圖像形態(tài)學(xué)處理比較Fig.5 Contrast of the yeast’s morphologically processing image

從圖5中可以看出，膨脹對填補圖像分割后物體中的空洞很有用。經(jīng)過腐蝕和膨脹處理后的酵母菌圖片邊緣沒有毛刺、內(nèi)部沒有空洞、得到了沒有雜質(zhì)存在的二值圖像，可以對其進行計數(shù)。

2.2 酵母菌總數(shù)測定

2.2.1 連通區(qū)域的標(biāo)記 采用連通判別法［12－14］對圖像處理后的酵母菌二值圖像進行連通區(qū)域標(biāo)記。具體算法為:將圖像按照從左向右，從上向下的順序掃描，如果遇到第一個前景點，假設(shè)為A點，把A點做種子點，將其標(biāo)記值設(shè)為1，并向外尋找與其鄰域相連的其它前景點，將找到的每個這樣點的標(biāo)記值都設(shè)為1，再分別以每個這樣的點為種子點繼續(xù)尋找，直至找不到未標(biāo)記過的相連的前景點為止，這樣一個連通區(qū)域就標(biāo)記完畢。如此反復(fù)，直到掃描完整幅圖像，最后把所有連通區(qū)域標(biāo)記完畢。

2.2.2 酵母菌的識別 如果所采集的酵母菌圖片中不含其它干擾物質(zhì)，那么圖像中的酵母菌數(shù)即為最大連通區(qū)域標(biāo)號數(shù)。但是由于培養(yǎng)基或者制作裝片過程受到污染，酵母菌圖像中就會有一些干擾雜質(zhì)。通過對酵母菌微觀形態(tài)圖片觀察和微觀尺寸測量可知，酵母菌在不同生長期的形狀都是卵圓形，多數(shù)是單體，少數(shù)帶有芽體;長約6～14μm，寬約4.5～8μm，長寬比小于2;干擾物質(zhì)的尺寸小，與酵母菌尺寸差異大。因此，引入形狀因子［13］對酵母菌進行識別。利用數(shù)學(xué)運算找到所標(biāo)記連通區(qū)域的長、寬、面積和周長，定義因子a，a=4πS/L2，其中S、L分別為連通區(qū)域的面積和周長，a的上限為1，因為酵母菌細胞多是卵圓形，所以a的上限取1.3;再定義b=c/d，其中c、d分別為連通區(qū)域的長和寬，對單體酵母菌，b小于2，對于有芽體的酵母菌，根據(jù)出芽酵母菌記數(shù)原則，芽體大小達到母細胞的一半時，作兩個菌體計數(shù)，此時b大于3。針對酵母菌形態(tài)，結(jié)合兩種形狀因子，制定如下識別規(guī)則:對酵母菌二值圖片中的連通區(qū)域，滿足d＞4.5μm，a＜1.3，且1≤b＜2的識別為1個酵母菌;滿足d＞4.5μm，2≤b≤3的識別為1個酵母菌;滿足d＞4.5μm，b＞3的識別為2個酵母菌。

2.2.3 酵母菌的數(shù)目統(tǒng)計 將連通區(qū)域標(biāo)記算法和酵母菌識別規(guī)則程序?qū)懭氲健敖湍妇嫈?shù)”菜單中。對顯微圖像處理過的酵母菌圖片，點擊“酵母菌計數(shù)”菜單進行酵母菌的數(shù)目統(tǒng)計為11。

應(yīng)用本方法對10份酵母菌裝片進行總數(shù)測定，并用顯微鏡直接計數(shù)法進行驗證，驗證結(jié)果用相對誤差表示，相對誤差=|人工計數(shù)－自動計數(shù)|÷自動計數(shù)×100%，結(jié)果見表1。

表1 酵母菌總數(shù)的檢測結(jié)果Table 1 Validation of the yeast’s total number

從表1可以看出，自動計數(shù)結(jié)果與人工計數(shù)結(jié)果(3次人工計數(shù)的平均值)相比較，最大相對誤差為6.67%，最小相對誤差為0，平均相對誤差為2.56%。使用本方法對每份酵母菌裝片檢測時間不超過8s。

3 結(jié)論

3.1 本文研究的顯微圖像處理方法，簡便快捷、檢測準(zhǔn)確，可以用于酵母菌總數(shù)的檢測，在以后的研究中應(yīng)進一步提高檢測方法的精度和速度。

3.2 針對酵母菌形態(tài)設(shè)計的連通區(qū)域標(biāo)記和形狀因子相結(jié)合的酵母菌識別記數(shù)方法，能夠區(qū)分干擾物質(zhì)和酵母菌，能很好地進行酵母菌的計數(shù)。

3.3 通過對酵母菌圖片進行處理，包括圖像預(yù)處理、圖像分割、圖像增強和圖像形態(tài)學(xué)處理，可得到非常清晰的酵母菌二值圖片，利于酵母菌的計數(shù)。

3.4 通過顯微鏡直接計數(shù)法驗證酵母菌自動計數(shù)方法，平均相對誤差為2.56%，對單個裝片的檢測時間不超過8s。

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Applying digital micro－image processing on rapid detecting the total number of yeast

SUN Zhong－lei1，WAN Peng2，*(1.College of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China;
2.College of Engineering，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

Digital micro－image processing technology on rapid detect the total number of yeast was studied.A detection system was made of the hardware and software，respectively.The biology microscope，CCD vidicon，image gathering card and computer were assembled the hardware，and the counting software was developed by Visual C++6.0 software.The image of Saccharomycse cerevisiae Hansen flake was gathered，processed，divided up，boosted up and morphologically processed by the detection system，then the yeast was identified and counted by the method of connected component labeling algorithm and shape factor.The result showed that the average error of detection system was 2.56%compared with directly counting using microscope，and detection time was less than eight seconds to one flake.The digital micro－image processing technology was simple，rapid and exact，which could detect the total number of yeast，and overcame the traditional microorganism counting.

yeast;microorganism counting;digital micro－image processing;rapid detection

TS207.4

A

1002－0306(2012)08－0105－04

酵母菌是一種常見的微生物，在食品發(fā)酵、釀造工業(yè)中廣泛應(yīng)用，但也是導(dǎo)致食品腐敗的重要因素，因此對酵母菌總數(shù)進行測定具有重要的意義。對于微生物的計數(shù)，目前主要采用顯微鏡直接計數(shù)法［1］及平板菌落計數(shù)法［2］，這兩種方法是經(jīng)典的微生物數(shù)目驗證方法，但是這些方法操作比較繁瑣、耗時較長、效率低，因此，急需一種簡便、快速的微生物計數(shù)方法。近年來，隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，圖像處理方法已經(jīng)和顯微鏡相結(jié)合，形成顯微圖像處理技術(shù)，應(yīng)用于微生物數(shù)目的快速統(tǒng)計。目前研究主要集中在基于RGB色度學(xué)原理，自動檢測菌落數(shù)量［3］;利用灰度圖像處理和形態(tài)學(xué)運算，進行細胞數(shù)目統(tǒng)計［4－6］;使用計算機視覺檢測系統(tǒng)，檢測食品細菌總數(shù)［7－8］;利用顯微鏡和圖像處理技術(shù)結(jié)合，分析微生物的三維形態(tài)結(jié)構(gòu)［9－11］。應(yīng)用顯微圖像處理技術(shù)對于酵母菌總數(shù)的檢測尚未見報道。本工作擬使用顯微圖像處理系統(tǒng)，分析酵母菌圖像，對酵母菌進行形態(tài)識別和數(shù)目統(tǒng)計，旨在研究一種簡便、快速的酵母菌總數(shù)檢測方法。

2011－07－27 *通訊聯(lián)系人

孫鐘雷(1979－)，男，博士研究生，講師，主要從事食品智能檢測與評價的研究。

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ101302);華中農(nóng)業(yè)大學(xué)引進人才科研啟動基金(52204－09079)。