劉珊，王小兵，李愛東，劉朝陽，田海梅，李茉，趙文雅，李艷芬，劉靜，宋培培，張偉

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，腫瘤醫(yī)院，生物檢測中心，北京100021; 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，腫瘤醫(yī)院，中心實驗室，北京100021)

亞麻籽木酚素預(yù)防乳腺癌及與雌激素的關(guān)系

劉珊1，王小兵1，李愛東2，劉朝陽1，田海梅1，李茉1，趙文雅1，李艷芬1，劉靜1，宋培培1，張偉1

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，腫瘤醫(yī)院，生物檢測中心，北京100021; 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，腫瘤醫(yī)院，中心實驗室，北京100021)

目的通過卵巢切除術(shù)建立雌性大鼠去勢模型，探究亞麻籽粉木酚素預(yù)防乳腺癌的功能及與雌性激素的關(guān)系。方法將48只雌性Wistar大鼠隨機分為基礎(chǔ)飼料組(BD)、基礎(chǔ)飼料去勢組(BDC)、亞麻籽粉組(FS)和亞麻籽粉去勢組(FSC)，每組12只，對全部大鼠進(jìn)行二甲基苯蒽(DMBA)一次性灌胃(2mg/kg體重)建立誘發(fā)的乳腺癌實驗動物模型;一周后對BDC組、FSC組大鼠行去勢手術(shù)，連續(xù)觀察21周，測定瘤體的體積和重量，并取乳腺組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果實驗期間動物一般狀況良好，實驗組大鼠未出現(xiàn)明顯毒副作用;亞麻籽粉組(FS和FSC組)大鼠發(fā)生可觸及腫瘤的時間較相應(yīng)對照組晚2到4周;亞麻籽粉組大鼠單純性增生和不典型增生以及乳腺癌發(fā)生率和病灶數(shù)均顯著低于相應(yīng)對照組(單純性增生:FS vs BD，P=0.006＊＊;FSC vs BDC，P＜0.001＊＊;不典型增生:FS vs BD，P=0.048*;FSC vs BDC，P=0.014*;乳腺癌:FS vs BD，P=0.028*;FSC vs BDC，P＜0.047*);亞麻籽粉組大鼠腫瘤體積和重量均小于基礎(chǔ)飼料組;FS和FSC組研究結(jié)果提示亞麻籽粉木酚素抑制增生發(fā)生及腫瘤細(xì)胞的生長的能力與實驗動物體內(nèi)雌性激素水平有關(guān)(單純性增生:P=0.008＊＊;不典型增生:P=0.042*;乳腺癌:P=0.033*)。結(jié)論亞麻籽粉木酚素可有效預(yù)防和降低化學(xué)誘癌劑DMBA所誘發(fā)的乳腺癌、癌前病變和單純性增生的發(fā)生，預(yù)防乳腺癌的功能和效果受到體內(nèi)雌性激素影響。本研究結(jié)果對未來實施木酚素預(yù)防乳腺癌及有效人群的篩選具有參考價值。

木酚素;亞麻籽粉;大鼠;乳腺癌

回顧性流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)婦女服用亞麻籽木酚素可顯著降低乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前婦女服用木酚素較絕經(jīng)后婦女服用木酚素更能顯著的降低乳腺癌的初發(fā)和復(fù)發(fā)風(fēng)險，因此推測木酚素在絕經(jīng)前、后婦女的預(yù)防乳腺癌功能的差異可能與婦女體內(nèi)雌性激素分泌及代謝水平有關(guān)［1，2］，但目前尚缺乏直接實驗證據(jù)支持上述觀點。

本研究將首次通過實驗動物模型研究并報道亞麻籽木酚素預(yù)防乳腺癌的功能效果及與雌激素關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雌性Wistar大鼠48只，體重200 g，購自華阜康生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證編號: SCXK(京)2009-0007，動物使用許可編號:SYXK (京)2008-0025。動物隨機分為4組:基礎(chǔ)飼料組(basal diet，BD)，基礎(chǔ)飼料去勢組(basal diet castrate，BDC)，亞麻籽粉組(flax seed，F(xiàn)S)，亞麻籽粉去勢組(flax seed castrate，F(xiàn)SC)，每組12只。

1.2 實驗儀器、材料、試劑及配制方法

二甲基苯蒽(7，12-Dimethylbenz［α］anthracene，DMBA)購自美國sigma公司。吐溫80購自北京化學(xué)試劑公司。1g DMBA溶于2 mL吐溫80，充分?jǐn)嚢?，乳化均勻后加入麻油?0 mL，振蕩助溶，終濃度20 mg/mL。大鼠基礎(chǔ)飼料購自北京華阜康生物科技有限公司;亞麻籽粉飼料為基礎(chǔ)飼料中添加10%的亞麻籽粉。戊巴比妥鈉購自北京索萊寶科技有限公司。脫毛劑為8%的硫化鈉溶液，硫化鈉購自北京化學(xué)試劑公司。稱取8g硫化鈉加入40 mL 75%的酒精，溫水定容到100 mL。光學(xué)顯微鏡型號:OLYMPUS，BH-2。

1.3 模型制作

全部大鼠基礎(chǔ)飼料飼喂，每籠兩只隔離飼養(yǎng)，溫度22～24℃，濕度50%～60%，飲用過濾水，飼料自由采食。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后灌胃，以二甲基苯蒽灌胃復(fù)制乳腺癌大鼠模型，劑量為20 mg/100 g體重。灌胃后一周，建立大鼠去勢模型，去勢組行卵巢切除手術(shù)，非去勢組行假手術(shù)。大鼠手術(shù)當(dāng)日晨起禁食禁水，行3%的戊巴比妥鈉50 mg/kg體重肌肉注射麻醉，脊柱雙側(cè)消毒，鋪巾，皮膚剪口，鈍性剝離至腹腔，結(jié)扎輸卵管，切除卵巢，縫合肌肉層及皮膚，注射青霉素，放回鼠籠。BD，F(xiàn)S組進(jìn)行假手術(shù)對照，只進(jìn)行脊柱雙側(cè)切口，卵巢附近的部分脂肪切除及肌肉皮膚縫合，一周后拆線。動物摘除卵巢后逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，參照正常大鼠性周期陰道細(xì)胞變化標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)觀察5 d，陰道上皮細(xì)胞無周期性變化，證明去勢模型建立成功。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般狀況觀察每天觀察記錄大鼠一般狀況和大鼠死亡情況，記錄大鼠腫瘤初發(fā)時間及部位，每周稱量并記錄大鼠體重、瘤體體積，處死后剝離瘤體稱重。

1.4.2 病理組織學(xué)觀察21周后斷頸處死大鼠，觀察并記錄乳腺腫塊數(shù)量、形態(tài)及大小。取材參考國內(nèi)常用大鼠乳腺取材方法，沿頸部至腹股溝備皮后，將6對乳腺連同周圍皮膚、皮下組織取下，PBS漂洗，10%福爾馬林固定24 h，乳腺組織自乳頭部對半切開，石蠟包埋，每個乳腺組織連續(xù)切片10張，二甲苯脫蠟，進(jìn)行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下組織學(xué)觀察乳腺腺體和導(dǎo)管上皮變化，以及相關(guān)改變的組織病理學(xué)特征。

1.5 計算方法

1.5.1 單純性增生:單純性增生發(fā)生率=乳腺單純性增生大鼠數(shù)/該組存活大鼠數(shù)×100%

平均單純性增生數(shù)=大鼠單純性增生發(fā)生總數(shù)/該組乳腺單純性增生大鼠數(shù)

單純性增生抑制率=(基礎(chǔ)組平均單純性增生數(shù)－給藥組平均單純性增生數(shù))/基礎(chǔ)組平均單純性增生數(shù))×100%。

1.5.2 不典型增生:不典型增生發(fā)生率=乳腺不典型增生大鼠數(shù)/該組存活大鼠數(shù)×100%

平均不典型增生數(shù)=大鼠不典型增生發(fā)生總數(shù)/該組乳腺不典型增生大鼠數(shù)

不典型增生抑制率=(基礎(chǔ)組平均不典型增生數(shù)－給藥組平均不典型增生數(shù))/基礎(chǔ)組平均不典型增生數(shù))×100%。

1.5.3 乳腺癌:乳腺癌發(fā)生率=癌變大鼠數(shù)/該組存活大鼠數(shù)×100%

平均癌變數(shù)=大鼠癌變發(fā)生總數(shù)/該組癌變大鼠數(shù)

抑癌率=(基礎(chǔ)組平均癌變數(shù)－給藥組平均癌變數(shù))/基礎(chǔ)組平均癌變數(shù)×100%。

比較各組單純性增生、不典型增生、乳腺癌發(fā)生情況，評價亞麻籽粉木酚素對乳腺單純性增生、癌前病變、乳腺癌生長的抑制作用。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用ˉx±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著意義，P＜0.01為差異具有極其顯著意義，繪圖采用Microsoft Excel軟件。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

48只實驗大鼠有3只死于腹瀉，其余45只大鼠在實驗結(jié)束時均存活;存活各組大鼠體重?zé)o明顯差異，見表1，飼料中添加亞麻籽粉對大鼠生活質(zhì)量無明顯影響。BDC組和BD組分別在誘癌劑灌胃給藥后第11周和第13周首次出現(xiàn)可觸及的乳腺部位腫塊;而FS，F(xiàn)SC組在給藥后第15周開始出現(xiàn)可觸及腫塊。記錄可觸及的大鼠腫塊數(shù)，病理診斷區(qū)分腫塊性質(zhì)。大體觀察腫瘤位于乳腺部位、質(zhì)硬，并呈侵襲性生長，與乳腺組織間無明顯分離，大的腫瘤可占據(jù)整個乳腺或超出乳腺范圍，個別可見侵及皮膚并形成潰爛。腫瘤瘤重及體積見表2。圖1示不同組大鼠乳腺體表可觸及腫瘤的生長情況，結(jié)果顯示不同時期亞麻籽粉組大鼠腫瘤體積和重量均明顯小于基礎(chǔ)組，可見亞麻籽粉組大鼠腫瘤初發(fā)時間較基礎(chǔ)組晚，解剖未發(fā)現(xiàn)肝、肺等重要臟器轉(zhuǎn)移灶。

表1 各組大鼠平均體重Tab．1Average body weight of rats in each group

2.2 大鼠病理組織學(xué)觀察結(jié)果

光鏡觀察結(jié)果顯示各組大鼠均發(fā)生單純性增生、不典型性增生及癌變(彩插6圖2)，同一大鼠的多個乳腺出現(xiàn)不同程度的增生或癌變。正常乳腺導(dǎo)管可見導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列有序，無明顯炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)結(jié)締組織增生;單純性增生可見導(dǎo)管上皮細(xì)胞失去正常的結(jié)構(gòu)和層次;不典型增生可見導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列較亂，細(xì)胞層次增多，極向消失，增生的細(xì)胞大小不一，可見核分裂象。浸潤性乳腺癌可見細(xì)胞排列失去極性，排列紊亂，核深染，病理性核分裂像常見。

2.3 評定指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)

乳腺增生情況參照人體乳腺不典型增生診斷標(biāo)準(zhǔn)評定。統(tǒng)計并比較分析各組單純性增生數(shù)、不典型增生(癌前病變)病灶數(shù)以及癌變病灶數(shù)，單純性增生統(tǒng)計指標(biāo)包括小葉增生、導(dǎo)管上皮增生、結(jié)締組織增生、導(dǎo)管內(nèi)增生;不典型增生統(tǒng)計指標(biāo)包括導(dǎo)管上皮不典型增生;癌變統(tǒng)計指標(biāo)包括導(dǎo)管內(nèi)癌、小葉原位癌、浸潤性癌等，結(jié)果見表3;計算相應(yīng)抑制率，結(jié)果體現(xiàn)亞麻籽粉組大鼠單純性增生，不典型增生，癌變病灶數(shù)目均低于相應(yīng)基礎(chǔ)組，其中FS組的誘發(fā)癌變抑制率明顯高于FSC組。大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)觀察部分有淋巴細(xì)胞浸潤，無癌前期和癌的改變。

表2 體表可觸及的乳腺癌瘤體平均重量及體積比較Tab.2Comparation of palpable tumor weights and volumes

圖1 亞麻籽粉及去勢對DMBA誘發(fā)大鼠體表可觸及的乳腺癌瘤體生長的影響Fig．1Impaction of Flax seed powder and castrated to DMBA-induced surface palpable breast tumor growth

3 討論

乳腺癌是成年女性最易患的惡性腫瘤之一，在歐美發(fā)達(dá)國家其發(fā)病率高居女性癌癥首位，是女性的主要死因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(IARC)最近的估計(GLOBOCAN 2008)，全球年新發(fā)女性乳腺癌病例達(dá)138萬，占全部女性惡性腫瘤發(fā)病的23%;死亡46萬，占所有女性惡性腫瘤死亡的14%;近年來，我國乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)快速明顯上升的趨勢，目前我國約有47萬乳腺癌患者，城市地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均位于女性常見惡性腫瘤前三位［3］。因此，如何降低乳腺癌的發(fā)病率和死亡率，開展對乳腺癌的發(fā)病和復(fù)發(fā)的預(yù)防的相關(guān)研究具有重要的實際應(yīng)用價值。

表3 DMBA誘發(fā)各組大鼠乳腺上皮單純性增生、不典型增生、乳腺癌的發(fā)生情況Tab．3The incidence of DMBA-induced mammary hyperplasia，mammary atypical hyperplasia and mammary carcinoma in rats

木酚素屬于植物類雌激素，是一種與動物雌激素結(jié)構(gòu)相似的生物活性物質(zhì)，其在亞麻籽中的含量取決于亞麻的品種、種植氣候和生態(tài)條件，一般約占籽重量的0.9%～1.5%，比其它66種已知含木酚素的植物高100～800倍。近年研究發(fā)現(xiàn)木酚素在預(yù)防糖尿病及心血管疾病、發(fā)揮弱雌激素及抗雌激素效應(yīng)、降血壓、調(diào)節(jié)膽固醇代謝、抗艾滋病病毒和抗肝炎病毒、預(yù)防和治療激素依賴腫瘤等方面都能發(fā)揮重要作用［4］，其中，木酚素對乳腺癌的預(yù)防和治療功能的研究更是成為當(dāng)今乳腺癌相關(guān)研究的熱點。

木酚素在動物消化道內(nèi)被微生物轉(zhuǎn)化成動物木酚素，即腸二醇和腸內(nèi)酯，二者均具有雌激素樣和抗雌激素樣生物活性，它們與體內(nèi)雌激素雌二醇結(jié)構(gòu)相似，能競爭性結(jié)合雌激素受體，從而抑制與雌激素相關(guān)的細(xì)胞和腫瘤的增殖［5，6］，因而可對激素相關(guān)性疾病和腫瘤表現(xiàn)出一定的治療作用。乳腺癌是激素依賴性的惡性腫瘤，研究亞麻籽粉木酚素在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的干預(yù)和預(yù)防作用及其與雌激素的關(guān)系，將為預(yù)防和治療乳腺癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)提供重要的科學(xué)依據(jù)。

化學(xué)致癌劑二甲基苯蒽可誘導(dǎo)Wistar大鼠發(fā)生乳腺單純性增生、不典型增生、原位癌和浸潤性乳腺癌，并表現(xiàn)為漸進(jìn)的譜帶演變過程［7，8］，這個過程與人體乳腺癌癌變過程極為相似，因此建立可靠科學(xué)的動物研究模型，研究木酚素對誘發(fā)乳腺癌前病變以及乳腺癌的抑制作用，可為探討乳腺癌的有效預(yù)防，以及研究木酚素預(yù)防乳腺癌的機制和效果產(chǎn)生重要影響;建立大鼠去勢模型研究雌性激素對亞麻籽粉木酚素抑癌作用的影響，在理論上可闡明亞麻籽粉木酚素的抑癌作用與雌性激素間的關(guān)系以及作用結(jié)果，將揭示影響木酚素抑制乳腺癌作用的途徑和機制，對于乳腺癌的預(yù)防和術(shù)后復(fù)發(fā)的控制和管理具有重要的指導(dǎo)價值。

由于人類和大鼠處于不同的生物階梯，藥物在體內(nèi)作用過程和藥效機制不可能完全相同［9，10］，且人類患癌可能會受到心理相關(guān)因素的影響，所以該研究結(jié)果尚不能完全用來解釋木酚素對人類乳腺癌的預(yù)防功能和作用機理，乳腺癌大鼠去勢模型不能完全替代人類絕經(jīng)后代謝的改變，因此利用木酚素代替或輔助藥物防癌抗癌尚需要后續(xù)人群研究加以證實，但木酚素在預(yù)防癌前病變，抑制癌細(xì)胞生長、降低血膽固醇水平等方面的研究確實展現(xiàn)出可喜的前景［11］，且我國藥用資源廣泛，研究費用低，因此對木酚素進(jìn)行深入研究，特別是對其防治乳腺癌的應(yīng)用研究具有重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景。

［1］Jianmin C，Jasdeep KS，Paul C，et al．Flaxseed and pure secoisolariciresinol diglucoside，but not flaxseed hull，reduce human breast tumor growth(MCF-7)in athymic mice［J］．Nutrition And Disease，2009，66(10):206－212．

［2］Katharina B，Aida KZ，Alina V，et al．Meta-analyses of lignans and enterolignans in relation to breast cancer risk［J］．Am J Clin Nutr，2010，12(2):141－148．

［3］Louis WC，Mary NC，Wings TL，et al．A rat cell line derived from DMBA-induced mammary carcinoma［J］．Life Sciences，2003，13(3):27－33．

［4］Cecile VS，Pierre D，Christe P，et al．Phytoestrogen rich diets modulate expression of brca1 and brca2 tumor suppressor genes in mammary glands of female Wistar rats［J］．Cancer Research，2003，63(10):6607－6612．

［5］Masao H，Atsuko M，Nobuyuki I，et al．Effects of dietary perila oil，soybean oil and safflower oil on 7，12-dimethylbenz［a］antfhracene(DMBA)and 1，2-dimethylydrazine(DMH)-induced mammary gland and colon carcinogenesis in female SD rats［J］．Carcinogenesis，1990，11(5):731－727．

［6］Zhou YJ，Liu YE，Cao JG，et al．Vitexins，nature-derived lignan compounds，induce apoptosis and suppress tumor growth［J］．Clin Cancer Res，2009，15(16):112－118．

［7］Dal ML，Zucchetto A，Talamini R，et al．Effect of obesity and other lifestyle factors on mortality in women with breast cancer［J］．Int J Cancer，2008，12(3):2188－2194．

［8］Susan EM，Paola M，Stephen B，et al．Dietary lignan intakes and risk of pre-and postmenopausal breast cancer［J］．Int J Cancer，2004，11(1):440－444．

［9］Anazi AF，Qureshi VF，Arbieri C，et al．Preventive effects of phytoestrogens against postmenopausal osteoporosis as compared to the available therapeutic choices:an overview［J］．J Nat Sci Biol Med，2011，2(2):154－163．

［10］Huis R，Morreel K，F(xiàn)liniaux O，et al．Natural hypolignification is associatedwithextensive oligolignol accumulationinflax stems．Plant Physiol，2012，2(13):342－351．

［11］Dong K，Pu JX，Zhang HY，et al．Lignans from Kadsura polysperma and Their Antineurodegenerative Activities［J］．J Nat Prod，2012，75(2):249－256．

Study of the Flaxseed Lignan on the Animal Model of Breast Cancer Prevention and the Relation with the Body Estrogen

LIU Shan1，WANG Xiao-bing1，LI Ai-dong2，LIU Zhao-yang1，TIAN Hai-mei1，LI Mo1，ZHAO Wen-ya1，LI Yan-fen1，LIU Jing1，SONG Pei-pei1，ZHANG Wei1
(1.Detection Center of Tumor Biology，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Central Laboratory，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo explore the function of flaxseed powder lingans on the prevention of breast cancer and the relation with estrogen on the ovariectomized female rats．MethodsFouty-eight female wistar rat were randomly divided into basal diet group(BD)，basal diet castrate group(BDC)，flaxseed group(FS)and flaxseed castrate group(FSC)，Allof the rats were treated with DMBA by intragastric administration at a dose of 2mg/kg weight to establish the experimental animal models of induced breast cancer and the BDC and FSC groups were operated for the ovariectomy．On the 21 week the volume and weight of the palpable tumors were measured and conducted pathological examination by pathologist．ResultsThe experimental animals were generally in well situation，there was no obvious toxic or side effect in experimental groups，palpable tumors appeared two to four weeks later in FS and FSC groups than that in the control; Compared with the control groups，the incidence and the average number of lesions of breast hyperplasia，atypical hyperplasia，breast cancer were significantly lower in flaxseed groups(hyperplasis:FS vs BD，P=0.006＊＊;FSC vs BDC，P＜0.001＊＊;atypical hyperplasia:FS vs BD，p=0.048*;FSC vs BDC，P＜0.014*;breast cancer:FS vs BD，P=0.028*; FSC vs BDC，P=0.047*)，additionally，the volume and weight of the tumors were lower in flaxseed groups．The results also suggested that the ability of inhibiting the hyperplasia and tumor cell growth of the flaxseed lignans is related with estrogen states(hyperplasis:P=0.008＊＊;atypical hyperplasia:P=0.042*;Breast cancer:P=0.033*)．ConclusionsFlaxseed powder lignans can effectively prevent and reduce the occurrence of breast cancer，precancerous lesions and hyperplasia induced by DMBA，and the preventive effect of flaxseed powder lignans are affected by body estrogen．The above results may be of reference value for screening effective population and preventing breast cancer by lignans．

Lingans;Flax seed;Rat;Breast cancer

R730.1;R737.9 R332

A

1671-7856(2012)06-0043-05

10．3969/j．issn．1671．7856．2012．06．010

2012-05-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(81071714)。

劉珊(1985－)，女，碩士生，研究方向:腫瘤預(yù)防。E-mail:candy_show@yeah．net。

張偉，男，研究員，E-mail:zhangww1954@126．com。