張黎黎，田順亮

（1.廣西桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院心胸外科，桂林 541001；2.廣西桂林醫(yī)學院人體解剖學教研室，桂林 541004）

在腦損傷實驗中，常用大鼠作為實驗動物建立腦損傷模型。大鼠腦損傷后，爬板實驗是檢測其神經(jīng)功能改變的一種常用方法［1，2］。在以往的試驗中，爬板實驗中多采用有機玻璃板外面蒙以絲網(wǎng)作為爬板［3］。由于這種爬板缺少其它的附屬裝置，常需要2個人一起才能完成實驗檢測；而且由于爬板缺乏良好的固定支撐，常導致實驗中爬板發(fā)生不必要的位置移動，實驗數(shù)據(jù)誤差較大；由于爬板只能向一端傾斜，放置鼠的位置和方向受到了限制，當測試過程中，大鼠出現(xiàn)了調(diào)頭爬行，就須重新檢測；當大鼠從爬板上滑脫到地面上時，會發(fā)生大鼠的逃逸、躲藏，難以找尋和捕捉，給實驗帶來很大的不便。

為了使科研工作者能輕松快捷地通過爬板實驗檢測大鼠腦損傷后神經(jīng)功能的改變，并提高實驗數(shù)據(jù)的準確性，防止實驗中大鼠逃逸，特設(shè)計制作了一種經(jīng)濟實用的爬板裝置，以保證實驗檢測的順利進行。

1 材料和方法

1.1 爬板實驗裝置的制作材料和方法（見圖1）

底槽的制作：選厚度為1.5 cm的木板，鋸切成左右長140 cm，上下高20 cm的底槽前板和底槽后板，以及左右長140 cm，前后寬20 cm的底槽底板。用螺絲釘將底槽前板和底槽后板分別固定在底槽底板的前、后側(cè)面上，制作成底槽。底槽兩側(cè)自然形成左、右兩個缺口。

活動擋板的制作：選厚度為1.5 cm的泡沫塑料板，裁切成水平部：左右寬6 cm，前后長20 cm，垂直部：上下高17 cm，前后寬20 cm的左擋板和右擋板。

活動擋板與底槽的連接：將左擋板和右擋板的水平部，沿著底槽底板分別經(jīng)左缺口和右缺口推向底槽內(nèi)，至兩擋板的垂直部正好將底槽的左缺口和右缺口封閉。

圖1 大鼠爬板實驗裝置示意圖Fig.1 Sketch map of the experimentalapparatus for rat climbing board test

豎桿的制作：選厚度為1 cm的木板，鋸切成上下高58 cm，左右寬10 cm的前豎桿和后豎桿。在兩豎桿上部距頂端5 cm處的中央位置，鉆一直徑為0.42 cm的孔，以孔為圓心，在孔的水平線下方用碳素筆做55°、60°、65°、70°和90°傾斜角刻度標示。

豎桿與底槽的連接：將前豎桿和后豎桿的下端分別與底槽前板和底槽后板側(cè)面的下端對齊，并用螺絲釘將其相互連接。

爬板的制作：選乳白色，厚度為1.5 cm的高密度板，鋸切成左右長100 cm，前后寬19 cm的主板，將孔徑為0.2 cm×0.2 cm的鋼絲網(wǎng)蒙于主板的上面，并拉緊鋼絲網(wǎng)繞經(jīng)主板的側(cè)面至主板的下面。取一左右長95 cm，前后寬10 cm，厚0.5 cm的木板，借助于小鐵釘將鋼絲網(wǎng)的斷端固定于木板和主板的下面之間，制作成爬板。在爬板前、后兩側(cè)面的中央部各鉆一直徑0.3 cm，深2.1 cm的小孔。

轉(zhuǎn)軸的制作：選兩個長5 cm的螺絲釘作為爬板裝置的轉(zhuǎn)軸。轉(zhuǎn)軸蓋直徑1 cm，上有一橫貫轉(zhuǎn)軸蓋的“一”形凹槽，凹槽寬0.12 cm，深0.15 cm。轉(zhuǎn)軸體部直徑為0.4 cm，長4.8 cm，其中螺紋部長2.3 cm，光滑部長2.5 cm。

爬板借轉(zhuǎn)軸與豎桿的連接：將爬板置于前豎桿和后豎桿上部之間，使爬板上的小孔與前豎桿和后豎桿上的孔相對齊。將兩個轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)軸體分別穿過前豎桿和后豎桿上的孔到達爬板側(cè)面上的小孔，經(jīng)小孔，將轉(zhuǎn)軸體的螺紋部旋入爬板內(nèi)，從而將爬板與前豎桿和后豎桿連為一體，而轉(zhuǎn)軸體部的光滑部則留置于前豎桿和后豎桿上的孔內(nèi)。當爬板向左、右傾斜運動時，其轉(zhuǎn)軸的光滑部作為軸心在孔內(nèi)轉(zhuǎn)動。

指針的制作：取一直徑0.08 cm，長15 cm的不銹鋼絲，將兩端用砂輪打磨圓滑即制作成指針。

指針與轉(zhuǎn)軸的連接：將轉(zhuǎn)軸的螺紋部經(jīng)爬板側(cè)面上的小孔旋入爬板后的最終狀態(tài)是：爬板和轉(zhuǎn)軸蓋上的“一”形凹槽23均處于水平位。此時，將指針水平置入凹槽3內(nèi)，并將兩者焊接牢固。

1.2 爬板實驗裝置的使用方法

實驗檢測時，將左擋板和右擋板的水平部，沿著底槽底板分別經(jīng)左缺口和右缺口向底槽內(nèi)推進，至兩擋板的垂直部正好將底槽的左缺口和右缺口封閉，使底槽形成只有上口開放的空間，可防止實驗中滑入底槽內(nèi)大鼠的逃逸；實驗者一只手把持爬板的一端，使爬板處于水平位；另一只手將大鼠置放于爬板的另一端，使鼠頭朝向爬板被手所持的一端；將爬板鼠尾所指向的一端緩緩向下傾斜，此時，指針隨同轉(zhuǎn)軸伴隨著爬板的傾斜而轉(zhuǎn)動，并在傾斜角刻度標示上，指示出相應(yīng)的傾斜角；當大鼠從爬板上向下滑脫時，記錄下此時指針所指示傾斜角。根據(jù)評分標準，按照傾斜角大小，得出神經(jīng)功能缺失分值。將大鼠從底槽中取出，放回飼養(yǎng)籠；檢測結(jié)束時，將左擋板和右擋板分別從底槽的左缺口和右缺口處拉出，清理底槽中的鼠便。

1.3 爬板實驗裝置的在大鼠腦缺血實驗中的應(yīng)用

1.3.1 動物分組

將24只體重250～300 g的成年雄性SD大鼠隨機分為3組。大鼠均由中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，SCXK-［軍］2007-004）。SYXK（津） 2008-0005。

Tβ4組：首先采用線栓法制作大腦中動脈栓塞（m idd le cerebral artery occlusion，MCAO）模型，隨后腹腔注射用0.01 mol/L的 PBS溶解的胸腺素 β4 （thymosineβ4，Tβ4）（北京諾思蘭德生物技術(shù)有限公司），注射劑量為5 mg/kg·w；

PBS組：在 MCAO的基礎(chǔ)上，腹腔注射與 Tβ4同等量的PBS；

sham組：進行假手術(shù)。

1.3.2 MCAO的制備方法

按350 mg/kg體重的劑量，對大鼠行10％水合氯醛腹腔注射麻醉；將大鼠仰臥固定于溫控動物手術(shù)臺上，術(shù)中溫度保持在37℃ ±0.5℃；剔去大鼠頸部體毛，用碘伏消毒頸部皮膚；于正中偏右側(cè)0.5 cm縱切頸部皮膚，切口長1.5～2 cm；將右側(cè)的下頜下腺向右側(cè)分離牽拉，向深層分離淺、深筋膜，清晰顯現(xiàn)右側(cè)的二腹肌后腹、肩胛舌骨肌和胸乳突??；在三塊肌所圍成的三角內(nèi)，解剖分離出右側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，用4-0號黑色絲線分別牽拉固定三個動脈，注意保護與動脈相鄰的迷走神經(jīng)、頸神經(jīng)以及頸部的交感神經(jīng)等；依次在近心端結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈；距頸總動脈分叉處約0.3 cm處，在頸總動脈壁上做尖端朝向近心端的“V”形切口；用4-0尼龍線制成線栓（用賴氨酸包被，長2.5 cm，直徑0.17 mm，頭端被燒灼成直徑約0.28 mm的圓滑小球），經(jīng)“V”形切口插入右頸總動脈，并經(jīng)右頸內(nèi)動脈向顱內(nèi)推進，推進深度為線栓頭端距頸總動脈分叉處約1.8 cm±0.2 cm，此時可阻斷右側(cè)大腦中動脈的血流；在右頸內(nèi)動脈近頸總動脈分叉處結(jié)扎頸內(nèi)動脈，固定線栓以防脫落；剪去線栓留在血管外的部分；將頸部各結(jié)構(gòu)復(fù)位，縫合頸部皮膚。

1.3.3 假手術(shù)方式

與實驗組和對照組手術(shù)方法基本相同，所不同的是：假手術(shù)組線栓推進的深度為線栓頭端距頸總動脈分叉處約1 cm，右側(cè)大腦中動脈仍可借助于大腦動脈環(huán)獲得血供。

1.3.4 爬板實驗檢測

應(yīng)用爬板實驗裝置，在術(shù)后1～7 d分別采用新裝置和原裝置檢測各組大鼠的神經(jīng)功能缺失評分。爬板實驗的評分方法是以大鼠從爬板上開始滑落時，爬板的傾斜角為依據(jù)進行打分，標準為：0分：≥70°；1分：≥65°；2分：≥60°；3分：≥55°；4分：≥ 50°；5分：＜50°。每只鼠重復(fù)3次，取平均分作為最終評分。

1.3.5 統(tǒng)計分析

在不同的時間點上，對3組大鼠的神經(jīng)功能缺失評分進行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

3組大鼠分別采用新裝置和原裝置進行爬板實驗，所檢測的神經(jīng)功能缺失評分見表1。

3 討論

3.1 新裝置檢測結(jié)果的分析

用新爬板實驗裝置所檢測的結(jié)果顯示，術(shù)后1 d，sham組也有一定的神經(jīng)功能缺失，這可能是因為手術(shù)的影響，以及右側(cè)頸總動脈結(jié)扎所引起右腦短暫少量缺血而引起的神經(jīng)功能改變；但由于分布到右側(cè)大腦的大腦前、中、后動脈并未受線栓的阻塞，仍可通過大腦動脈環(huán)從椎動脈及對側(cè)的頸總動脈獲得足夠的血供，所以癥狀輕微，且在術(shù)后2 d，神經(jīng)功能缺失評分即為0分。在術(shù)后1 d、2 d，Tβ4組和PBS組神經(jīng)功能缺失都比較嚴重，兩者評分都明顯高于sham組（P＜0.05），但兩者之間卻無明顯差異（P＞0.05），這可能是：兩組都經(jīng)受了手術(shù)的打擊和因大腦中動脈缺血所造成的腦損傷；隨著時間的推移，兩組神經(jīng)功能缺失評分都在逐步降低，這與大鼠逐步從手術(shù)的打擊和因大腦中動脈缺血所造成的腦損傷中逐步恢復(fù)相關(guān)。從術(shù)后3 d開始至術(shù)后7 d的各時間點，Tβ4組大鼠神經(jīng)功能缺失評分都低于PBS組（P＜0.05），且與sham組相比，評分雖比sham組高但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而PBS組則明顯高于sham組（P＜0.05），這說明Tβ4組的神經(jīng)功能恢復(fù)要好于PBS組，原因可能是Tβ4具有抗炎、抗凋亡作用［4］，MCAO后Tβ4對腦組織的保護作用而使神經(jīng)功能得以較快的恢復(fù)。這樣的結(jié)果同時說明，所設(shè)計的爬板實驗裝置可以良好地檢測出大鼠腦損傷后神經(jīng)功能缺失狀況。但從術(shù)后3 d開始至術(shù)后7 d的各時間點，Tβ4組大鼠神經(jīng)功能缺失評分與sham組相比，評分雖比sham組高但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）這一結(jié)果看，爬板實驗有一定的局限性，應(yīng)結(jié)合其他的實驗才能做出更精確的評定。但這只是爬板實驗自身的局限性，而非新爬板裝置的原因。

3.2 新裝置和原裝置檢測結(jié)果的比較

Tβ4組和PBS組的檢測結(jié)果顯示，用新裝置的檢測評分在逐步平緩下降，5 d后，仍可檢測到神經(jīng)功能缺失，這比較切合大鼠術(shù)后功能逐步恢復(fù)的病理過程；用原裝置的檢測評分雖然也在逐步下降，但呈跳躍式下降，5 d后均未能檢出神經(jīng)功能缺失。

將Tβ4組和PBS組的檢測結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)：采用新裝置，3 d后，均可檢出兩者之間的差異（P＜0.05）；采用原裝置，3 d時未檢出差異（P＞0.05），4d時檢出了差異（P＜0.05），但隨后均未能再檢出兩者之間的差異（P＞0.05）。

將Tβ4組的檢測結(jié)果與sham組進行比較發(fā)現(xiàn)：采用新裝置，前3 d，均可檢出兩組之間的差異（P＜0.05）；采用原裝置，只檢出前 2 d的差異（P＜0.05），隨后未能檢出差異（P＞0.05）。

表1 神經(jīng)功能缺失評分（±s）Tab.1 Nerve function loss score（±s）

表1 神經(jīng)功能缺失評分（±s）Tab.1 Nerve function loss score（±s）

注：a為在各時間點，Tβ4組、PBS組分別與Sham組相比，P＜0.05；b為在各時間點，Tβ4組與PBS組相比，P＜0.05Note：a：At each time point，when the nerve function loss score of the Tβ4 group and the PBSgroup was compared with that of the Sham group separately，P＜0.05；b：At each time point，when the nerve function loss score of the Tβ4 group was compared with that of the PBS group，P＜0.05

1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus新裝置New apparatus原裝置Primary apparatus Tβ4組Tβ4 group 3.00± 0.53a 2.00± 1.04a 2.00± 0.93 a 1.50± 1.20 a 0.88± 0.99 ab 0.38± 0.74 0.63± 0.92b 0.13± 0.35b 0.25± 0.46b 0±0 0.25± 0.46b 0±0 0.13± 0.35b 0±0 PBS組PBS group 3.00± 0.76 a 2.88± 1.13 a 2.00± 0.76 a 1.63± 1.19 a 1.75± 0.46 a 1.13± 0.99a 1.75± 0.46 a 0.75± 0.71 a 1.38± 0.52 a 0±0 1.00± 0.53 a 0±0 0.88± 0.35 a 0±0 Sham組Sham group 1.13± 0.83 0.75± 0.46 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

將PBS組的檢測結(jié)果與 sham組進行比較發(fā)現(xiàn)：采用新裝置，可檢出兩組間在術(shù)后一直存在著差異（P＜0.05）；采用原裝置，只檢出前4 d的差異（P＜0.05），隨后未能檢出差異（P＞0.05）。

對比發(fā)現(xiàn)，新裝置的檢測評分更符合術(shù)后大鼠的病理過程，評分更為準確，也能更有效地檢測出因?qū)嶒炓蛩厮斐傻拇笫筮\動功能的差異。

3.3 新裝置的有益之處

在實際應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)新裝置的有益之處在于：爬板借助于豎桿、底槽得到了穩(wěn)固的支撐，實驗操作得以簡便，一個人即可完成實驗檢測。爬板可在穩(wěn)固的框架上靈活轉(zhuǎn)動，指針和傾斜角刻度也比較穩(wěn)定，實驗數(shù)據(jù)的準確性得以提高。裝置的前、后兩側(cè)都設(shè)置有指針和傾斜角刻度標示，實驗人員在裝置的前、后都可進行實驗操作和觀察記錄。爬板以中心部位為轉(zhuǎn)軸，既能向左側(cè)，也能向右側(cè)行90°的傾斜，可確保不論大鼠處于爬板的哪一端，實驗檢測都可進行；即使鼠在檢測過程中出現(xiàn)了調(diào)頭現(xiàn)象，也可通過改變爬板的傾斜方向繼續(xù)進行測試，實驗操作非常便利。爬板裝置配有底槽和活動擋板，實驗時，將擋板插入底槽兩端，可防止滑落入底槽內(nèi)大鼠的逃逸；實驗結(jié)束時，拔出擋板，便于對底槽進行衛(wèi)生清潔。爬板裝置制作所需材料為常見的木板、泡沫塑料板、高密度板、鋼絲網(wǎng)等，制作簡單，經(jīng)濟實用。

［1］蔡光先，劉柏炎，賴鼎元，等.神經(jīng)干細胞移植對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2007，17 （24）：2971-2973.

［2］徐鵬，付曉宇，仲維高.人參皂甙 Rb1對大鼠局灶性腦缺血腦組織膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 mRNA表達的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（23）：3582-3585.

［3］魏爾清，朱朝陽，徐秋琴，等.一種改進的小鼠局灶性腦缺血神經(jīng)癥狀定量評價方法［J］.生理學報，2003，55（6）：742 -747.

［4］Allan L.Goldstein，Ewald H.et al.Thymosinβ4：actinsequestering protein moonlights to repair injured tissues［J］.2005，11（9）：421-429.

［5］Philp D，K leinman HK.Animal studies with thymosin beta，a multifunctional tissue repair and regeneration peptide［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1194：81-86.