鄭旭銳，楊 宇，葉建紅，周新穎，惠 毅，朱素有，張顯明，馮賢榮

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046）

中醫(yī)基礎(chǔ)理論藏象學(xué)說認(rèn)為，人體臟和腑是相互聯(lián)系的，臟病合腑，腑病合臟，五臟各有其所合之腑，比如“肺合大腸”、“心合小腸”、“脾合胃”等等。《內(nèi)經(jīng)》曰“肺合大腸”即說的是“肺與大腸相表里”，近年來關(guān)于這個理論的類似研究比較多［1-6］，但大多是從肺病入手研究所合之臟“腸”，至今還沒有學(xué)者從腸病入手研究其所合之臟“肺”的特異性研究。本次實(shí)驗(yàn)欲通過觀察腸病 (便秘模型)和肺腸合病 (過敏性哮喘合并便秘模型)大鼠五臟(心、肝、脾、肺、腎)組織中膽囊收縮素八肽 (CCK8)、降鈣素相關(guān)基因肽 (CGRP)、P物質(zhì) (SP)、血管活性腸肽 (VIP)表達(dá)探討“肺與大腸相表里”理論。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 雄性SPF級Wistar大鼠30只，體質(zhì)量 (180±20)g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司 (動物合格證號:scxk(m)2008-15)提供。

1.2 試劑及藥物 復(fù)方地芬諾酯片 (DC，為河南焦作市博愛藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，購自成都博康醫(yī)藥公司，批號:09033001)；1%卵白蛋白 (OVA，為Sigma公司產(chǎn)品，購自四川科達(dá)有限公司)；氫氧化鋁 (成都市科龍化工試劑廠，批號:20080807)；生理鹽水 (四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字H51021158)；兔SPKit免疫組化試劑盒 (貨號:SP9001，購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；CCK8、CGRP、SP、VIP免疫組化試劑盒 (均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號:bs0764r，bs0077r)；DAB免疫組化顯色試劑盒 (貨號:ZLI9032，購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器及設(shè)備 稱重天平 (為廣州中山市新和基科技開發(fā)有限公司產(chǎn)品，型號:ACS-3C型)；石蠟切片機(jī) (德國Leica切片機(jī)2016型)；光學(xué)顯微鏡 (日本制造，Olympus BHS型顯微鏡)；超聲霧化器 (為廣州粵華醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品，型號:WH-203型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法 將30只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組:空白對照組、腸病組 (便秘組)、肺腸合病組 (哮喘合便秘組)，每組均10只大鼠。

2.1.1 腸病 (便秘)模型的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］方法進(jìn)行改進(jìn)，將10只大鼠均按10 mg/kg的劑量給予DC灌胃，采取隔天灌胃一次的方法 (為了保持大鼠持續(xù)的便秘狀態(tài))。我們根據(jù)大鼠糞便的情況［以糞便干燥、粒形縮短、排出費(fèi)力，日排出量低于正常參考值范圍 (4.28～11.18g)為診斷大鼠便秘的標(biāo)準(zhǔn)［9］］來判斷腸病模型是否成功。

2.1.2 肺腸合病 (哮喘合便秘)模型的制備［10］將1 mg卵白蛋白和200 mg氫氧化鋁溶于1 mL生理鹽水中配制成致敏劑，分別在第0天和第7天在大鼠腹腔內(nèi)注射致敏劑。從第14天開始即將腸病組和肺腸合病組這兩組大鼠分別置于10 cm×10 cm×20 cm的有機(jī)玻璃盒內(nèi)，為誘發(fā)哮喘，我們用霧化器對這兩組大鼠進(jìn)行超聲霧化吸入1%的卵白蛋白 (模型成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠出現(xiàn)煩躁、咳嗽、打噴嚏、呼吸急促、腹肌強(qiáng)烈收縮等典型哮喘樣發(fā)作)，30 min/次，1次/d，共計1周；同時給予這兩組大鼠復(fù)方地芬諾酯片(按10 mg/kg的劑量)灌胃，采取隔天灌胃1次的方法。具體方法見腸病組。

2.2 標(biāo)本采集和檢測方法 取材:模型成功后各組大鼠用頸椎脫臼法處死后立即開胸腹取出五臟:心、右肝、脾、右肺、腎組織，用多聚甲醛溶液固定，常規(guī)酒精梯度脫水后用二甲苯透明，最后石蠟包埋，制成厚度約4 μm的切片，行免疫組織化學(xué)染色，免疫組化操作步驟按說明書進(jìn)行。結(jié)果判定以細(xì)胞漿或膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞；最后各組大鼠五臟組織染色后的切片均在OLYMPUS DP70型彩色圖文系統(tǒng)下選取5個不同的視野用20倍的物鏡進(jìn)行拍照，然后用型號為IMAGE-PRO PLUS 6.0的計算機(jī)圖象分析軟件進(jìn)行定量分析，測定拍好的每張照片累積積分光密度 (IOD)，最后對每張切片的5個IOD求平均值后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.3 統(tǒng)計方法 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以表示，如果數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布的情況下采用非參數(shù)檢驗(yàn)，均數(shù)比較若方差不齊則需采用Tamhane’s T2進(jìn)行分析，若方差齊性則采用單因素方差分析，以P＜0.05為有差異。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 空白對照組大鼠飲食未發(fā)生明顯變化，且毛色有光澤，體質(zhì)量呈逐漸增加的趨勢；腸病組大鼠則表現(xiàn)為精神比較差，食少，毛色逐漸失去光澤，體質(zhì)量逐漸減輕；肺腸合病組大鼠則精神差，毛色沒有光澤且凌亂不堪，稱質(zhì)量則發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量明顯減輕。

3.2 五臟組織免疫組化檢測結(jié)果

3.2.1 空白對照組 CCK8、VIP、SP在心肌呈弱表達(dá)，染色較淺，CGRP表達(dá)較強(qiáng)，染色變深；CCK8在肝臟表達(dá)較弱，染色較淺，而CGRP、SP、VIP則表達(dá)較強(qiáng)，染色變深；CCK8在脾臟表達(dá)較弱，染色較淺，CGRP、SP、VIP則表達(dá)較強(qiáng)，染色變深；在肺臟可見CCK8、VIP陽性纖維分布較多，染色變深，而CGRP、SP陽性纖維分布則較少，染色較淺；CCK8、SP在腎臟的表達(dá)較弱，染色較淺，而CGRP、VIP表達(dá)較強(qiáng)，染色變深。

3.2.2 腸病組 CCK8、SP、VIP在心肌的陽性表達(dá)有所增強(qiáng)，而CGRP的表達(dá)減弱；CCK8在肝臟的表達(dá)增強(qiáng)，而SP、VIP、CGRP的表達(dá)減弱；CCK8在脾臟的表達(dá)增強(qiáng)，而SP、VIP、CGRP的表達(dá)減弱；CCK8、VIP在肺的表達(dá)減弱，而CGRP、SP的表達(dá)增強(qiáng)；CCK8、SP在腎臟的表達(dá)增強(qiáng)，而VIP、CGRP的表達(dá)減弱。

3.2.3 肺腸合病組 CCK8、SP、VIP在心肌的陽性表達(dá)有所增強(qiáng)，而CGRP的表達(dá)減弱；CCK8在肝臟的表達(dá)增強(qiáng)，而SP、VIP、CGRP的表達(dá)減弱；CCK8、CGRP在脾臟的表達(dá)增強(qiáng)，而SP、VIP的表達(dá)減弱；CCK8、VIP在肺的表達(dá)減弱，而CGRP、SP的表達(dá)增強(qiáng)；CCK8、CGRP、SP在腎臟的表達(dá)增強(qiáng)，而VIP的表達(dá)減弱。

3.2.4 統(tǒng)計結(jié)果顯示

3.2.4.1 心、肝、脾、腎組織 與空白對照組比較，腸病組、肺腸合病組心、肝、脾、腎組織中CCK8、CGRP、SP、VIP表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，見表1～4。

表1 各組大鼠心組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

表1 各組大鼠心組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

注:與空白對照組比較，P＞0.05。

組別 膽囊收縮素八肽 降鈣素相關(guān)基因肽 P 物質(zhì) 血管活性腸肽空白對照組 811.17±4511.45 6554.86±4619.74 5584.33±3414.13 10116.88±3787.42腸病組 5903.45±3145.78 6126.40±4533.55 8543.59±3102.86 10966.71±5658.90肺腸合病組 6137.94±2284.91 4964.55±3693.82 7813.64±6431.50 12382.84±4901.98

表2 各組大鼠肝組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

表2 各組大鼠肝組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

注:與空白對照組比較，P＞0.05。

組別 膽囊收縮素八肽 降鈣素相關(guān)基因肽 P 物質(zhì) 血管活性腸肽空白對照組 15030.47±7470.15 25760.85±12639.19 26383.18 ±22161.41 40781.87 ±12824.34腸病組 15332.44±14685.25 15555.02±10281.93 25381.43±7117.36 37019.71±13400.82肺腸合病組 22912.15±9739.29 17858.58±11612.12 25998.59 ±13009.75 38007.13 ±13421.22

表3 各組大鼠脾組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

表3 各組大鼠脾組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

注:與空白對照組比較，P＞0.05。

組別 膽囊收縮素八肽 降鈣素相關(guān)基因肽 P 物質(zhì) 血管活性腸肽空白對照組 36536.84±7251.90 25596.08±13205.64 80233.06 ±39447.34 77958.05 ±15638.41腸病組 40503.64±12008.31 20067.98±11119.13 56061.19±34879.85 62186.70 ±17639.13肺腸合病組 42533.15±6792.53 28622.78±7663.76 75064.30 ±22940.87 76563.57 ±30857.64

表4 各組大鼠腎組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

表4 各組大鼠腎組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

注:與空白對照組比較，P＞0.05。

組別 膽囊收縮素八肽 降鈣素相關(guān)基因肽 P 物質(zhì) 血管活性腸肽空白對照組 13726.77±4168.17 17266.65±9534.84 16291.56 ±10562.12 34375.77 ±6647.82腸病組 13990.44±7721.45 11843.58±8044.52 19023.14±9302.61 27820.96 ±12483.48肺腸合病組 15790.74±5389.09 19995.72±9915.97 20545.28 ±8268.55 28833.27 ±9986.66

3.2.4.2 肺組織

與空白對照組比較 腸病組大鼠肺組織CCK8、VIP表達(dá)明顯減少，經(jīng)統(tǒng)計有差異 (P＜0.01)，CGRP、SP表達(dá)增多，經(jīng)統(tǒng)計有差異 (P＜0.05)；肺腸合病組大鼠肺組織CCK8、CGRP、SP、VIP表達(dá)明顯增多，經(jīng)統(tǒng)計均有差異 (P＜0.01)。

與腸病組比較 肺腸合病組大鼠肺組織CCK8、CGRP、VIP表達(dá)明顯增多，經(jīng)統(tǒng)計均有差異 (P＜0.01)，SP表達(dá)減少，經(jīng)統(tǒng)計有差異 (P＜0.05)；見表5。

表5 各組大鼠肺組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

表5 各組大鼠肺組織膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽表達(dá)()

注:與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01；與腸病組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別 膽囊收縮素八肽 膽囊收縮素八肽 P 物質(zhì) 血管活性腸肽空白對照組 103558.42±23911.36 24720.64±10040.42 51350.98±15780.76 39318.30±8817.29腸病組 81325.15±16538.2△△ 37033.88±11605.58△ 75729.89±22590.37△ 29241.50±7595.49△△肺腸合病組 28590.37±8680.06△△★★ 52977.99±10930.04△△★★ 103103.13±27210.77△△★ 13373.23±5047.88△△★★

4 討論

中醫(yī)基礎(chǔ)理論藏象學(xué)說認(rèn)為五臟為心、肝、脾、肺、腎，而六腑為小腸、膽、胃、大腸、膀胱、三焦，臟合腑，腑合臟，臟腑各有所合，如心與小腸相合，肝與膽相合，脾與胃相合，肺與大腸相合，腎與膀胱相合等等，在臟腑相合理論中“肺與大腸相合”即“肺與大腸相表里”是近年來大家關(guān)注的焦點(diǎn)［11-13］。

4.1 肺和大腸理論關(guān)系 在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中肺被稱為“華蓋”之臟，是五臟六腑之蓋，其通于天氣，開竅于鼻，上通于喉，在體合皮。《內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為肺“司呼吸”，“通調(diào)水道”，“主宣降”；大腸為“傳導(dǎo)之官，變化出焉”，所以大腸的傳導(dǎo)功能，有賴于肺氣的肅降，肺氣下降大腸才能傳遞糟粕，大便才能得以通暢。肺和大腸之間互相影響，如肺主宣發(fā)是大腸濡潤的基礎(chǔ)，肺主治節(jié)則是大腸正常傳導(dǎo)的條件，肺主通調(diào)水道是大腸潤燥的樞紐，肺主肅降則是大腸傳導(dǎo)的動力，一旦二者任何一方發(fā)生病變就可以相互傳變、累及，造成惡性循環(huán)。

4.2 腸病模型和肺腸合病模型 腸病模型選用復(fù)方地芬諾酯制備大鼠便秘模型，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)［7-8］。此模型是一種非特異性便秘模型，具有制備簡單易行，成功率高，且與臨床便秘相似，故是較常使用的腸病模型。

肺腸合病模型是課題組前期研究工作成功建立的合病模型［10］。由于近年來圍繞“肺與大腸相表里”理論進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究很多，有腸病及肺、肺病及腸的實(shí)驗(yàn)研究［18］，但均為單一的肺病或腸病模型，為了探索肺和腸病理上互相影響的程度，我們在前期研究中成功建立了肺腸合病 (過敏性哮喘合并便秘)模型。

4.3 關(guān)于膽囊收縮素八肽、降鈣素相關(guān)基因肽、P物質(zhì)、血管活性腸肽 膽囊收縮素 (CCK)是一種廣泛分布在消化系統(tǒng)，中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的腦腸肽［14-17］。天然CCK有多種分子形式，以羥基端酰胺化的CCK8和CCK58為主要形式。CCK8對胃腸運(yùn)動具有重要影響，如可以促進(jìn)胰酶分泌和膽囊收縮，并可協(xié)同促胰液素促進(jìn)胰液HCO3-分泌，能松弛Oddi擴(kuò)約肌，降低下食管擴(kuò)約壓力，減緩胃排空，增強(qiáng)小腸和結(jié)腸運(yùn)動等多方面功能，因而CCK8很可能是肺腸關(guān)系中非常重要的腦腸肽之一。

降鈣素相關(guān)基因肽 (CGRP)是肺內(nèi)感覺神經(jīng)末梢和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一種重要生物活性肽，參與呼吸道生理和病理生理機(jī)制，分為α-CGRP和β-CGRP兩種亞型，其主要功能是引起氣道血管舒張。有研究表明CGRP還具有強(qiáng)烈的收縮支氣管作用［18］。臨床研究亦表明，CGRP能抑制結(jié)腸縱、環(huán)行肌的自主收縮，抑制直腸縱行肌、肛門內(nèi)括約肌的收縮［19］。

P物質(zhì) (SP)是氣道非腎上腺能和非膽堿能 (NANC)神經(jīng)系統(tǒng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，為某些免疫細(xì)胞的產(chǎn)物，在哮喘發(fā)病機(jī)制中作用突出［20］。研究亦表明［21］SP是調(diào)節(jié)腸道作用最強(qiáng)的興奮性肽能神經(jīng)遞質(zhì)，能抑制腸道黏膜分泌，刺激腸道運(yùn)動，可直接作用大腸縱行肌環(huán)行肌引起收縮，增加結(jié)腸收縮和運(yùn)動。

血管活性腸肽 (VIP)在胃腸道中含量最高，主要分布于黏膜固有層和肌層神經(jīng)纖維。在肺內(nèi)分布量也很多［22］。在哮喘發(fā)作的病理情形下，VIP能發(fā)揮神經(jīng)源性支氣管舒張作用，可拮抗PGF2、血管舒緩素、組胺等介質(zhì)的支氣管收縮作用，同時參與調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞組織胺釋放過程。VIP在胃腸道主要參與大小腸的舒張，抑制胃酸及胃泌素分泌，促進(jìn)胰腺的水分及碳酸氫鹽分泌，并可刺激大小腸分泌腸液。

4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)肺和大腸的生理病理關(guān)系和CCK8、CGRP、SP、VIP意義，為了證實(shí)“肺與大腸相表里”理論，課題組遂選取實(shí)驗(yàn)大鼠五臟:心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行觀察，通過觀察腸病和肺腸合病大鼠五臟組織中CCK8、CGRP、SP、VIP表達(dá)變化情況探尋大腸和五臟中哪一臟存在互相影響。

研究結(jié)果表明，腸病和肺腸合病模型大鼠出現(xiàn)了肺組織CCK8、CGRP、SP、VIP表達(dá)的變化，而心、肝、脾、腎組織中CCK8、CGRP、SP、VIP表達(dá)未見明顯變化，而且肺腸合病組肺組織中CCK8、CGRP、SP、VIP表達(dá)變化比單純的腸病組明顯，這似乎說明“肺與大腸相表里”理論具有一定的特異性，大腸的病變只是影響到了肺，而并未影響到五臟中的其他四臟，而且肺和腸之間還存在互相影響的情況，這似為“肺與大腸相表里”理論提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此結(jié)果還提示CCK8、CGRP、SP、VIP可能是肺與大腸相聯(lián)系的共同物質(zhì)基礎(chǔ)，肺與大腸在病理情況下相互影響可能是通過中CCK8、CGRP、SP、VIP的相關(guān)調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。

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