鄭海峰，王英妹，武鐵軍，李慶祥，張 健，段國(guó)辰

（1.邢臺(tái)市第三醫(yī)院胸外科，河北 邢臺(tái) 054000；2.邢臺(tái)市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 054000；3.河北省人民醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050051）

常用的化療藥物雖然具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，但毒副作用也相對(duì)較大，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性。目前抗癌藥物的研究已逐漸轉(zhuǎn)向天然動(dòng)植物，我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥已越來越受到人們的青睞，中醫(yī)中藥治療腫瘤已成為腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色。黃芩苷 (baicalin)是一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分，具有抗氧化、誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、神經(jīng)保護(hù)、抗血管增殖、抗菌等藥理作用［1-5］。有研究表明，黃芩苷能夠抑制黏液表皮樣癌腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有顯著的抗腫瘤作用［6］。本研究觀察了黃芩苷體外對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討黃芩苷是否具有抑制A549細(xì)胞的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 肺腺癌A549細(xì)胞株細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；黃芩苷購(gòu)自南京青澤醫(yī)藥公司，純度:99.1%；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌A549細(xì)胞株培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液，含10%小牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置37℃、CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌細(xì)胞A549，按1×104/孔接種于96孔板內(nèi)。以倍比稀釋的方法由高到低分別加入不同濃度的黃芩苷 (10、5、2.5、1.25、0.625、0 mg/L)，藥物分別作用24、48、72 h，加入MTT(每孔終質(zhì)量濃度為0.5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入二甲基亞砜 (DMSO)100 μL，振蕩，充分溶解后，用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值，按下述公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率%=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。每組6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制50%的藥物濃度 (IC50)值及10%的藥物抑制濃度 (IC10)值。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分2組:對(duì)照組 (培養(yǎng)液)、黃芩苷 (1.22 mg/L)作用組，作用24 h后，Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，并以紫外分光光度法測(cè)定RNA的純度及含量。按照試劑盒說明書，各樣品分別取2 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。每樣品分別取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物建立PCR反應(yīng)體系。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)作為內(nèi)參照基因。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸反應(yīng)10 min。引物序列如下:Caspase-3:上游5'-GGACAACAACGAAACCTCCG-3'，下游5'-CTCCACTGGTATCTTCTGGCA-3'，PCR片段為568 bp；Bcl-2:上游5'-AGAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，下游5'-TCAAA GAAGGC CACAATCCTC-3'，PCR片段為373 bp；Bax:5'-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3'，5'-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3'，PCR片段為337 bp；內(nèi)參照GAPDH:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下 游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，PCR片段為452 bp。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀進(jìn)行DNA電泳條帶分析，以目的基因與GAPDH的光密度比值表示其mRNA表達(dá)水平。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用 ()表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 不同處理組分別培養(yǎng)24、48、72 h，黃芩苷對(duì)A549敏感細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，并且具有量效、時(shí)效關(guān)系。見圖1。黃芩苷作用A549細(xì)胞IC10值分別為:1.22、0.71、0.65 mg/L，IC50值分別為:7.38、5.04、3.94 mg/L，確定細(xì)胞抑制率≤10%的濃度為非細(xì)胞毒性濃度，因此選黃芩苷質(zhì)量濃度為1.22 mg/L作用24 h作為試驗(yàn)的安全劑量。

圖1 黃芩苷對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用

2.2 黃芩苷對(duì)A549細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組細(xì)胞相比，黃芩苷處理組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高 (P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著下降 (P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著降低 (P＜0.01)。見表1，圖2。

表1 黃芩苷對(duì)A549細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達(dá)的影響(RF-PCR結(jié)果)(x ± s，n=6)

圖2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)的變化

3 討論

肺腺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，肺腺癌死亡居惡性腫瘤首位［7］，同時(shí)，由于缺乏有效的早期發(fā)現(xiàn)手段，中晚期病例5年生存率僅約10%［8］，化療依然是肺腺癌治療的主要手段之一，但不良反應(yīng)及多藥耐藥的形成嚴(yán)重影響化療效果和患者生存質(zhì)量，是臨床肺腺癌化療失敗的重要原因，而中醫(yī)中藥恰恰彌補(bǔ)了這些不足。中醫(yī)認(rèn)為肺癌是由于邪毒內(nèi)侵、肺絡(luò)受損、氣血虛弱、痰瘀阻肺導(dǎo)致的。因此，針對(duì)病機(jī)結(jié)合中藥治療以提高化療效果、減輕毒副反應(yīng)已成為當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)。

黃芩為唇形科植物，其干燥根味苦，性寒。歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎等功效。黃芩苷是從黃芩中分離出來的黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要有效成分，具有多種藥理作用［1-5］。也有研究表明，黃芩苷能抑制Mc3腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及促進(jìn)調(diào)亡［6］。本研究通過MTT法試驗(yàn)證實(shí)，黃芩苷能夠顯著抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，提示其對(duì)肺腺癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

為了探討黃芩苷對(duì)肺腺癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，探討黃芩苷對(duì)肺腺癌細(xì)胞影響的機(jī)制。Caspase-3被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，所以，本實(shí)驗(yàn)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷作用后，細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平升高，提示黃芩苷具有促進(jìn)肺腺癌SGC27901細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡過程中的一類重要調(diào)節(jié)因子，Bcl-2位于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體膜上，其主要生物學(xué)功能為延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，增加細(xì)胞對(duì)多種凋亡刺激因素的抵抗性［9］，Bcl-2作為凋亡抑制蛋白，除可通過多種途徑抑制凋亡，還可導(dǎo)致腫瘤MDR［10］，本研究顯示，A549細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)量在黃芩苷作用后明顯下降，提示黃芩苷可通過抑制Bcl-2表達(dá)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗。與Bcl-2相同，Bax位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜的胞質(zhì)面上，是Bcl-2的同源體，能與Bcl-2形成異源二聚體，抑制Bcl-2作用。Bcl-2/Bax也能形成同源二聚體，抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷作用后A549細(xì)胞Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2/Bax比值顯著降低，說明該藥可使腫瘤細(xì)胞易于凋亡。

本研究初步證實(shí)黃芩苷可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡，具有抑制肺腺癌的生長(zhǎng)作用。但本研究?jī)H檢測(cè)了凋亡相關(guān)因子mRNA水平的表達(dá)變化，具體的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未深入研究；另外，應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以期更好的為黃芩苷誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡、改善肺腺癌治療效果提供理論依據(jù)。

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