王 耀，方 輝，高 萬，侯建國，劉圓圓，趙 烽

（煙臺大學 藥學院，山東 煙臺 264005）

連翹，又名旱蓮子（《藥性論》）、大翹子（《新修本草》），為木犀科植物連翹Forsythia suspensa Thunb.的干燥果實［1］。味苦微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結的功效，主治癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋尿閉［2］等。本文研究了連翹乙醇提取物對脂多糖（LPS）誘導小鼠巨噬細胞釋放炎性介質（NO、TNF-α）及一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表達的影響，以期探討連翹抗炎的相關機制。

1 材料

連翹（產(chǎn)地陜西）購自煙臺生生堂藥房有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；LPS、MTT購自Sigma公司；0.25%胰酶消化液、小鼠TNF-αELISA試劑盒為煙臺賽爾斯生物技術有限公司產(chǎn)品；anti-murine iNOS polyclonal antibody，COX-2（murine）polyclonal antibody購自Cayman公司；β-actin antibody購自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

2 方法

2.1 提取

將藥材放入1000mL的圓底燒瓶中，加8倍量70%乙醇，接上冷凝管，置于水浴中加熱回流提取2h。提取液抽濾，藥渣再加入6倍量70%乙醇加熱回流提取1h。合并2次提取液，減壓濃縮回收乙醇，得提取浸膏，干燥稱重。實驗前以DMSO溶解配制成所需濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)及傳代

小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代。

2.3 NO濃度測定及細胞生長活性檢測

按照文獻［3］中所述的方法進行測定。

2.4 ELISA法測定TNF-α濃度

取RAW 264.7細胞，以每毫升含5×105個細胞的密度接種于96孔板（每孔200μL），每組設3個平行孔。培養(yǎng)1h后給藥，6h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法進行測定，根據(jù)標準曲線計算TNF-α的濃度。

2.5 Western Blot法檢測iNOS、COX-2及內參蛋白βactin表達水平

藥物干預24h后，棄去上清液，加入PBS清洗，細胞刮收集細胞，1000r·min-1離心3min，留細胞，繼續(xù)加入PBS，超聲破碎細胞，10000r·min-1離心5min，取上清用Bradford法進行蛋白定量，取等量蛋白行10%SDS-PAGE電泳。轉膜后室溫封閉1h，分別加入iNOS、COX-2、β-actin一抗溶液，4℃孵育過夜，洗膜；HRP標記的二抗溶液室溫孵育1h，加入ECL化學發(fā)光液，X光片顯影。

3 結果

3.1 連翹提取物對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO的抑制作用

空白組中NO濃度僅為2.59μmol·L-1，在1μg·mL-1的LPS刺激下，巨噬細胞釋放出大量的 NO（16.42 μmol·L-1），經(jīng)3～4次重復實驗表明兩組間有顯著性差異（P＜0.01），表明LPS能誘導RAW 264.7細胞釋放大量炎性介質NO。與LPS組相比，經(jīng)連翹提取物作用后，NO的含量明顯減少，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關系。結果見表1。

表1 連翹對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO的抑制作用

3.2 連翹提取物對RAW 264.7細胞增殖無顯著影響

連翹提取物在12.5～100μg·mL-1濃度范圍內，對RAW 264.7細胞的正常增殖均無明顯抑制作用，高濃度下（100μg·mL-1）作用24h后，給藥組細胞的存活率為100.28%，無細胞毒性。

3.3 連翹提取物對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放TNF-α水平的影響

如表2所示，空白組中 TNF-α的濃度為73.11 pg·mL-1，經(jīng)LPS刺激6h后，細胞釋放大量的TNF-α，此時TNF-α的濃度為2745.67pg·mL-1，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.01）。連翹提取物可以明顯抑制LPS誘導RAW 264.7細胞釋放 TNF-α。

表2 連翹提取物對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放TNF-α的抑制作用

3.4 連翹對iNOS、COX-2蛋白水平的影響

Western印跡結果表明，連翹提取物干預后iNOS蛋白水平明顯降低，而COX-2蛋白水平無明顯改變，見圖1。

圖1 連翹對iNOS、COX-2蛋白水平的影響

4 討論

NO是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化以L-精氨酸為底物生成的［4］，在機體的很多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，調節(jié)NO的生成及iNOS的表達被認為是治療某些疾病的重要手段［5］。國內外經(jīng)常把連翹和其它的中草藥配伍，制成復方制劑應用于臨床，但其分子作用機理尚不十分清楚。本研究針對連翹提取物對LPS誘導巨噬細胞釋放NO、TNF-α等炎癥因子的抑制作用進行了研究，結果表明其能顯著抑制RAW 264.7細胞分泌NO和TNF-α，并且對iNOS蛋白表達水平也有抑制作用。由此可以明確連翹是通過調控巨噬細胞iNOS通路發(fā)揮抗炎作用。

［1］宋立人，洪恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學大辭典［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1041.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：117.

［3］趙凱華，趙烽，劉珂.腺梗豨薟提取物對脂多糖活化巨噬細胞釋放一氧化氮的抑制作用［J］.煙臺大學學報：自然科學與工程版，2009，22（2）：137-140.

［4］ZAMBONI DS，RABINOVITCH M.Nitric oxide partially controls Coxiella burnetti PhaseⅡinfection in mouse primary macrophages［J］.Infect Immun，2003，7（1）：1225-1229.

［5］KLEINERT H，PAUTZ A，LINKER K，et al.Regulation of the expression of inducible nitric oxdie synthase［J］.Eur J Pharmacol，2004，500（13）：255-266.