崔建梅，付 芳，賀繼平，宋憲強(qiáng)，于 芳

隨著年齡的增大，機(jī)體各臟腑器官功能逐漸退化，使老年人對外界環(huán)境改變的應(yīng)激能力明顯降低，記憶功能逐漸減弱，學(xué)習(xí)記憶隨著機(jī)體的老化，出現(xiàn)腦老化。腦老化即腦認(rèn)知功能下降、減退，初期最典型的表現(xiàn)是記憶力下降，極端形式是老年癡呆。此病是以學(xué)習(xí)記憶能力減退、認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)的慢性腦組織退行性疾病，是繼心臟病、癌癥、腦卒中之后的第4位致死原因[1]。腦老化至今病因未明，普遍認(rèn)為其形成主要與遺傳因素、氧化損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、腦組織缺血缺氧等因素關(guān)系密切。運(yùn)動作為預(yù)防和延緩腦衰老的方法之一越來越受到人們的重視。多數(shù)研究表明，合理的運(yùn)動能夠促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)活力、改善心血管功能、提高機(jī)體免疫力，從而延緩衰老、延長壽命。并且長期慢性運(yùn)動可以延緩與衰老相關(guān)的精神功能的減退，對學(xué)習(xí)記憶有良好的影響[2]，但是具體機(jī)制尚不清楚。

大量研究表明，衰老使機(jī)體抗氧化能力降低，導(dǎo)致自由基異常堆積，與衰老所致的記憶力減退有關(guān)[3]。海馬（Hippocampus）是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在信息處理中起著重要作用，是研究動物和人類學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典腦區(qū)，又是最易受衰老影響的腦區(qū)之一[4]。依據(jù)細(xì)胞形態(tài)、不同皮質(zhì)區(qū)發(fā)育的差異及纖維排列不同可將海馬劃分為4個不同區(qū)域：CAl、CA2、CA3和DG區(qū)。不同區(qū)域的功能不盡相同，海馬的CAl、CA3、DG區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中擔(dān)負(fù)著尤其重要的作用[5-6]。中樞乙酰膽堿（ACh）是參與學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，海馬-邊緣系統(tǒng)中有豐富的膽堿能纖維和膽堿敏感細(xì)胞及受體，與學(xué)習(xí)記憶密切關(guān)系[7]。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesteras，AchE）作為Ach的重要水解酶，其活性的改變可間接反映膽堿能神經(jīng)元活性的變化。一氧化氮（nitric oxide，NO）在記憶的形成中起逆向信使作用，參與長時程增強(qiáng)LTP的形成。在正常生理情況下，神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）催化產(chǎn)生的NO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的信使分子，在學(xué)習(xí)記憶機(jī)制中具有重要作用[8]。以上資料表明：衰老導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與腦自由基、中樞神經(jīng)遞質(zhì)Ach水平及腦組織NO水平有關(guān)，但是神經(jīng)遞質(zhì)Ach與腦自由基及海馬CAl、CA3、DG區(qū)nNOS的關(guān)系，以及長期游泳運(yùn)動改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制尚不清楚。而且以往的研究對象主要是藥物致大鼠衰老模型，且同時涉及海馬3區(qū)（CAl、CA3、DG）的研究較少?；谶@方面的考慮，本研究以海馬CAl、CA3、DG區(qū)為研究重點(diǎn)，測試自然衰老大鼠游泳運(yùn)動8周后空間學(xué)習(xí)記憶能力、腦自由基（SOD、GSH-px、MDA）、乙酰膽堿酯酶（AchE）活性及海馬 CAl、CA3、DG區(qū)nNOS的變化，探討游泳運(yùn)動提高衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 動物及分組

健康老年SD大鼠40只（24月齡），雌雄各半，體重330～350 g；成年組20只（3月齡），體重220～250 g，均購于山西醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心。常規(guī)分籠（每籠2～3只），標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料常規(guī)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，室溫21℃～25℃，濕度50%～60%，通風(fēng)良好，自然光照。將40只衰老大鼠隨機(jī)分為2組，即衰老對照組（aging control group，AC）、衰老運(yùn)動組（aging exercise group，AE），每組20只。成年對照組（adult control group，C）20只，其中10只用于腦自由基（SOD、GSH-Px、MDA）及AchE活性的測試，其余10只用于海馬CAl、CA3、DG區(qū)nNOS的測試。

1.2 試 劑

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽合成酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）、乙酰膽堿酯酶（AchE）及nNOS測定試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.3 訓(xùn)練方案

成年對照組、衰老對照組不施加任何干擾因素，籠中自由飲食、飲水、自由活動。衰老運(yùn)動組游泳8周，運(yùn)動負(fù)荷參照徐波等游泳訓(xùn)練方法，且略加改動[9]。衰老運(yùn)動組適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，正式實(shí)驗(yàn)時，大鼠每周一至周六（約 18：00～20：00）進(jìn)行 60 min/次的無負(fù)重游泳訓(xùn)練，后4周訓(xùn)練每周遞增15 min，共8周，游泳水溫（30±1）℃。

1.4 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)程序

所有大鼠在第9周周五進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前大鼠先在迷宮中適應(yīng)2 d，每天2次（第8周周六、周日），適應(yīng)時3～4只大鼠同時置于迷宮中，自由活動和攝取食物10 min。第9周周一、周二進(jìn)行每天2次的訓(xùn)練，訓(xùn)練時只有固定的四臂2、4、6、8號臂中放置餌片，該次序在整個實(shí)驗(yàn)過程維持不變，任其在迷宮中尋找食物10 min。正式實(shí)驗(yàn)前2天所有大鼠限制飲食，第9周周五正式實(shí)驗(yàn)，正式實(shí)驗(yàn)時2、4、6、8號臂放置食物，大鼠放于迷宮中央?yún)^(qū)平臺，用一玻璃罩蓋住，并將通往8個臂的口堵住，15 s后開放洞口并開啟分析測試軟件，測試定時10 min。大鼠可自由選擇進(jìn)入任意一臂以攝取食物，大鼠進(jìn)入有食物的臂且攝取食物為1次正確選擇，否則為錯誤選擇。分析軟件分析記錄大鼠錯誤選擇的次數(shù)，錯誤選擇次數(shù)分為工作記憶錯誤（working memory error，WME）：大鼠重新進(jìn)入放食物臂或第一次進(jìn)入放食物臂而不攝取食物的次數(shù)；參考記憶錯誤（reference memory error，RME）：大鼠進(jìn)入不放食物臂的次數(shù)；總記憶錯誤（total error，TE）：WME、RME 兩者之和。每只大鼠上、下午各測試1次，共2次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 腦自由基及乙酰膽堿酯酶活性測試

八臂迷宮行為測試后第2天，將每組大鼠取10只斷頭處死，迅速取出腦組織，將腦組織制成10%的組織勻漿上清液，用冷生理鹽水按1∶9稀釋成10%組織勻漿，3 000～4 000 r/min車速離心15 min，取上清液進(jìn)行 SOD、GSH-px、MDA及乙酰膽堿酯酶（AchE）的測定，按試劑盒說明書測定各個指標(biāo)的活性及含量。

1.6 腦組織取材與切片

八臂迷宮行為測試后第2天，將每組剩余10只大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（2%，40 mg/kg）腹腔注射麻醉，打開胸腔，刺針插入心臟至升主動脈，迅速剪破右心耳，快速灌入300 mL冷生理鹽水，隨即灌入300 mL 4%多聚甲醛（先快后慢）進(jìn)行前固定，再以10%蔗糖磷酸緩沖液灌入300 mL，至肝臟變硬變白為止。最后迅速取腦，取出后放在上述相同4℃固定液中固定2 h，再浸入含20%蔗糖的PBS溶液中4℃保存過夜，待組織完全下沉后冷凍切片，隔4取1，片厚40μm。

1.7 ABC免疫組織化學(xué)染色

腦切片經(jīng)Triton X-100（0.5%，37℃）PBS磷酸緩沖液孵育40 min，0.01M PBS液漂洗3次后入0.3%雙氧水PBS液中孵育15min。然后加入正常山羊血清（1∶60）工作液孵育1h，再加入nNOS血清兔抗大鼠第一抗體37℃孵育5 h。后加入生物素羊抗兔第二抗體37℃孵育40 min，DAB呈色20 min，然后置入0.2%明膠溶液裱片，酒精梯度脫水、透明、封片。

1.8 圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理

用數(shù)碼生物顯微鏡（德國Leica）和JD－801（江蘇捷達(dá)）顯微圖像分析軟件，參照大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)的位置（見圖1、圖2），測定海馬以上3區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)。每組大鼠各隨機(jī)選取雙側(cè)海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS的切片20張，10×40倍光鏡下計數(shù)nNOS陽性神經(jīng)元的個數(shù)、面積和灰度。

圖1 大鼠腦切片，箭頭所示海馬CA1/CA3/DGFigure1 the brain slices of rats，Hippocampu CA1/CA3/DG

圖2 海馬CA1/CA3/DG區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元（×100）Figure2 the distribution of the nNOS within CA1/CA3/DG（×100）in the Hippocampus

采用SPSSl7．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析法（ANOVE）對組間差異進(jìn)行統(tǒng)計，P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠八臂迷宮行為測試結(jié)果

圖 3 結(jié)果顯示：與成年對照組（360．32±87．89）s比較，衰老對照組（527．45±103．56）s完成八臂迷宮時間顯著延長（P＜0．01），平均延長 167．13 s。衰老對照組工作記憶錯誤次數(shù)（6．01±2．56次，WME）顯著增多（P＜0．01），平均增加 3 次；參考記憶錯誤次數(shù)（5．65±2．65 次，RME）顯著增多（P＜0．01）；總錯誤次數(shù)（11．66±4．53 次，TE）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年對照組（P＜0．01），平均增加 7．21 次。而衰老運(yùn)動組與成年對照組比較，完成八臂迷宮時間顯著延長（P＜0．05），平均延長 75．11 s；RME（3．75±1．42 次）顯著增多（P＜0．05），WME 增多，但沒有顯著差異（P＞0．05），TE 顯著高于成年對照組（P＜0．05），平均增加 3．75 次。

與衰老對照組比較，衰老運(yùn)動組RME及TE均顯著減少（P＜0．05，P＜0．01），總錯誤次數(shù)比衰老對照組減少 3．46 次；WME（4．65±1．76 次）減少，但沒有顯著差異（P＞0．05）。完成八臂迷宮的時間比衰老對照組顯著縮短（P＜0．05），減少 92．02 s。表明長期游泳運(yùn)動可以改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖3 大鼠八臂迷宮測試結(jié)果Figure3 Results of 8-arms radial maze in rats

2.2 大鼠腦自由基及AchE活性測試結(jié)果

與成年對照組比較，衰老對照組大鼠超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物（GSH－Px）活性顯著減弱（P＜0．01），SOD 活性下降 28．11 nU/mL，GSH－Px 活性下降 1．68 μmol/mg；丙二醛（MDA）含量增多（P＜0．01），平均增加 2．08 nmol/mL。與衰老對照組比較，衰老運(yùn)動組大鼠SOD活性顯著增強(qiáng)（P＜0．01），平均增加11．47 nU/mL；GSH－Px活性增強(qiáng)，但沒有顯著差異（P＞0．05）；MDA 含量顯著下降（P＜0．05），平均減少 1．4 nmol/mL。表明長期規(guī)律的、維持一定時間的游泳運(yùn)動可有效地增加衰老大鼠腦組織的抗氧化能力（見表1）。

與成年對照組比較，衰老對照組及衰老運(yùn)動組大鼠AchE活性均顯著增強(qiáng)（P＜0．01，P＜0．05），衰老對照組平均增加34．34 μ/g。與衰老對照組比較，衰老運(yùn)動組大鼠AchE活性顯著減弱（P＜0．01），平均降低 15．91 μ/g，降低幅度 12%（見表 1）。表明長期游泳運(yùn)動可減弱衰老大鼠腦組織的AchE活性，從而增加大腦乙酰膽堿的含量，改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

表1 大鼠腦自由基及AchE活性測試結(jié)果一覽表（±s，n=10）Table1 Results of brain free radical and AchE activities in rats（±s，n=10）

表1 大鼠腦自由基及AchE活性測試結(jié)果一覽表（±s，n=10）Table1 Results of brain free radical and AchE activities in rats（±s，n=10）

注：##P＜0.01，#P＜0.05，與成年對照組比較；**P＜0.01，*P＜0.05，與衰老對照組比較（下同）。

組別 AChE/μ·g-1 MDA/nmol·mL-1 GSH-px/μmol·mg-1 SOD/nU·mL-1成年對照組 96.02±23.56 2.05±0.32 4.50±1.03 68.67±8.96衰老對照組130.36±20.36##4.13±0.72##2.92±0.53##40.56±6.89##衰老運(yùn)動組114.45±34.21##*2.73±0.88#*3.23±3.03##52.03±4.56##**

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果

海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS陽性表達(dá)產(chǎn)物為深褐色，呈錐形或卵圓形，染色均勻，主要位于神經(jīng)元的胞體和突起的胞漿內(nèi)，但細(xì)胞核未被染色，突起較明顯（見圖4－6）。

圖4 海馬CA1區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元分布Figure4 The distribution of the nNOS immunoreactive neurons in the Hippocampus CA1

圖5 海馬CA3區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元分布Figure5 The distribution of the nNOS immunoreactive neurons in the Hippocampus CA3

圖6 海馬DG區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元分布Figure6 The distribution of the nNOS immunoreactive neurons in the Hippocampus DG

衰老對照組及衰老運(yùn)動組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著低于成年對照組（P＜0．01，P＜0．05），灰度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；經(jīng)過8周游泳運(yùn)動，衰老運(yùn)動組大鼠海馬CA1區(qū)免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和面積表達(dá)均增加（P＜0．05），灰度增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）（見表 2）。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（±s，n=10）Table2 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA1 of rats（±s，n=10）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（±s，n=10）Table2 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA1 of rats（±s，n=10）

組別 統(tǒng)計片 面積/μm2 個數(shù)/個 灰度成年對照組 20 760.68±121.36 7.32±1.25 103.21±21.95衰老對照組 20 348.34±79.45##3.28±0.79##98.78±10.64衰老運(yùn)動組 20 568.34±133.58#*5.32±1.24#*101.38±15.68

2.4 各組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果

衰老對照組及衰老運(yùn)動組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著少于成年對照組（P＜0．01，P＜0．05），灰度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；經(jīng)過8周游泳運(yùn)動，衰老運(yùn)動組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和面積表達(dá)均增加（P＜0．05），灰度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）（見表 3）。

表3 各組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（±s，n=10）Table3 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA3 of rats（±s，n=10）

表3 各組大鼠海馬CA3區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（±s，n=10）Table3 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus CA3 of rats（±s，n=10）

組別 例數(shù) 統(tǒng)計片 面積/μm2 細(xì)胞個數(shù) 平均灰度成年對照組 10 20 565.92±78.41 5.24±1.34 109.14±17.54衰老對照組 10 20 264.62±95.05##2.45±1.9##95.57±12.57衰老運(yùn)動組 10 20 339.12±69.43#*3.14±0.85#*103.36±24.16

2.5 各組大鼠海馬DG區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果

衰老對照組及衰老運(yùn)動組海馬DG區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著低于成年對照組（P＜0．01），灰度值顯著降低（P＜0．01）；經(jīng)過8周游泳運(yùn)動，衰老運(yùn)動組大鼠海馬DG區(qū)nNOS免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和陽性產(chǎn)物面積表達(dá)均增加（P＜0．05），灰度值顯著增加（P＜0．01）（見表 4）。

表4 各組大鼠海馬DG區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（±s，n＝10）Table4 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus DG of rats（±s，n＝10）

表4 各組大鼠海馬DG區(qū)nNOS神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（±s，n＝10）Table4 Results of Image Pattern Analysis of nNOS Immune Positive Cells in the Hippocampus DG of rats（±s，n＝10）

組別 統(tǒng)計片 面積/μm2 細(xì)胞個數(shù) 平均灰度成年對照組 20 1638.23±321.41 13.24±4.32 86.14±17.56衰老對照組 20 1034.62±195.05##8.56±1.19##78.57±12.58##衰老運(yùn)動組 20 1339.12±169.49#*11.14±0.85#*82.36±24.16**

3 討 論

3.1 游泳運(yùn)動對衰老大鼠大腦乙酰膽堿酯酶活性及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

中樞膽堿能系統(tǒng)被認(rèn)為是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要通路。Ach是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)從事和維持高級神經(jīng)功能活動的一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它廣泛分布于海馬、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、紋狀體、邊緣系統(tǒng)、杏仁核等，Ach的不足直接影響中樞膽堿能通路（學(xué)習(xí)記憶的主要通路）。DEUTSCH等通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿與學(xué)習(xí)、記憶的形成和儲存有關(guān)[10]。ZHANGW等發(fā)現(xiàn)給動物注射擬膽堿藥物能提高老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，而抗膽堿藥物則減弱大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[11]。Ach是由膽堿乙?；负铣?，膽堿酯酶（AchE）分解，通過乙酰膽堿受體發(fā)揮生物效應(yīng)。由于Ach性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易水解，極難準(zhǔn)確測定其含量，而AchE是Ach的降解酶，測定腦組織中AchE的活性，可判斷腦內(nèi)Ach含量的變化。因此，目前許多研究均以AchE活性作為反映中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能狀態(tài)的重要指標(biāo)[12]，AchE活性增高反映機(jī)體體內(nèi)Ach含量不足。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠腦組織中AchE明顯升高，可能會引起Ach含量不足，與JHA等研究結(jié)果一致[13]。

學(xué)習(xí)記憶是腦的高級功能，是衡量人類智能發(fā)育的重要指標(biāo)。衰老是一種正常而復(fù)雜的生物學(xué)過程，在衰老過程中，機(jī)體出現(xiàn)各種功能下降及生理紊亂現(xiàn)象，學(xué)習(xí)記憶伴隨著機(jī)體的老化，也明顯減退。目前，從整體水平上研究動物學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀卸喾N，八臂迷宮已被公認(rèn)為一種檢測大鼠空間記憶能力的常用實(shí)驗(yàn)裝置，它由一個中心區(qū)和其周圍連接的八條臂組成。它需要大鼠在多次的訓(xùn)練中，通過觀察周圍一些固定的參照物來學(xué)習(xí)和記憶自身與置于迷宮臂末端的白色小食丸——食餌的相對位置，獲得辨別空間方位的能力[14]。（1）參考記憶錯誤，反應(yīng)了大鼠尋找食物的空間認(rèn)知能力和遠(yuǎn)記憶情況。如果大鼠具有良好的空間認(rèn)知能力，就能根據(jù)迷宮周圍的參照物，能夠有效地尋找到食物。（2）工作記憶錯誤，反應(yīng)了大鼠近記憶情況，如果大鼠近記憶良好，在尋找到食物后會立即進(jìn)食，且進(jìn)食后不會再返回重新攝食。本研究采用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)法對老齡大鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與成年對照組比較，衰老對照組完成八臂迷宮時間延長167．13 s，工作記憶錯誤次數(shù)平均增加3次，說明衰老大鼠隨著年齡的增長，學(xué)習(xí)記憶功能嚴(yán)重下降。這可能與衰老大鼠AchE活性增強(qiáng)有關(guān)，AchE的經(jīng)典作用是使Ach分解生成膽堿和乙酸，在終止神經(jīng)傳遞中起重要作用，保持其功能正常是學(xué)習(xí)記憶的必要條件[15]。本實(shí)驗(yàn)中，AchE活性異常增高，造成腦內(nèi)Ach含量下降，引起膽堿能投射系統(tǒng)傳遞功能減弱，可能是導(dǎo)致衰老大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力發(fā)生障礙的一個重要原因，與FUKUI[16]研究結(jié)果一致。運(yùn)動作為一種抗衰老的手段已有近百年的歷史。研究認(rèn)為，經(jīng)常進(jìn)行體育運(yùn)動能改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能，促進(jìn)智力的發(fā)展，使記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生變化，增強(qiáng)人的記憶力，提高大腦的工作效率，延緩大腦衰老[17]。本實(shí)驗(yàn)得出相同結(jié)果，與衰老對照組比較，經(jīng)過8周游泳運(yùn)動的衰老大鼠進(jìn)入不放食物臂的次數(shù)及總錯誤次數(shù)顯著減少，總錯誤次數(shù)平均減少2次。表明可能長期游泳運(yùn)動能減弱大鼠大腦AchE活性，使Ach分解減少，改善膽堿系統(tǒng)功能，進(jìn)而改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降及衰老健忘等癥狀。

3.2 游泳運(yùn)動對衰老大鼠大腦自由基活性的影響

衰老的自由基理論認(rèn)為衰老是細(xì)胞成分積累性氧化損傷的結(jié)果，是由自由基反應(yīng)引起的，自由基反應(yīng)引起環(huán)境、疾病和遺傳控制的與衰老過程有關(guān)的衰老性改變[18]。研究表明，老年人在增齡的過程中，人體的防御功能減弱，腦自由基的清除能力降低，這些自由基能損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致其功能嚴(yán)重破壞，從而使學(xué)習(xí)記憶能力下降，進(jìn)而引起AD[19]。SOD和GSH－Px是機(jī)體2種重要的抗氧化酶，SOD能催化超氧陰離子生成過氧化氫，而GSH－Px則能迅速清除過氧化氫。MDA是脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，可間接反映自由基對機(jī)體的損傷程度。因此MDA和SOD可間接反映腦組織中氧自由基含量的變化和腦組織的損傷程度，是反映機(jī)體衰老情況的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示：衰老對照組大鼠腦組織中的SOD及GSH-px活性較成年對照組明顯降低，SOD平均降低28.11 nU/mL，降低幅度為41%；GSH-px平均降低 1.58μmol/mg，MDA含量顯著增加，平均增加2.08 nmol/mL，表明衰老大鼠機(jī)體抗氧化、清除自由基的能力嚴(yán)重受損。多數(shù)研究表明：AB蛋白在突觸可塑性和早期記憶功能的損害中發(fā)揮重要作用[20]；而氧自由基能促進(jìn)AB的毒性和聚集，使其在腦內(nèi)過度活躍，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，可能損傷膽堿能神經(jīng)元[21]，從而導(dǎo)致衰老，使學(xué)習(xí)記憶能力下降，可能是腦自由基導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的機(jī)制之一。研究認(rèn)為，長期有氧訓(xùn)練有利于促進(jìn)自由基的消除，抑制增齡引起的抗氧化能力降低，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化系統(tǒng)的平衡，對機(jī)體產(chǎn)生有益影響，這是運(yùn)動延緩腦衰老的主要機(jī)制之一[22]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，衰老大鼠經(jīng)過8周游泳運(yùn)動使腦組織中SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量明顯下降，表明長期游泳運(yùn)動可提高機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，從而增強(qiáng)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3.4 游泳運(yùn)動對衰老大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS表達(dá)的影響

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要區(qū)域，在衰老過程中海馬等結(jié)構(gòu)功能紊亂是學(xué)習(xí)記憶能力降低的重要原因[23]。海馬神經(jīng)元的長時程增強(qiáng)作用（LTP）是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，是由相互聯(lián)系的CA1、CA3和DG區(qū)等多個區(qū)域組成，且海馬CA1、CA3和DG區(qū)是LTP形成及學(xué)習(xí)記憶的重要部位，在學(xué)習(xí)記憶中擔(dān)負(fù)著尤其重要的作用[24-25]。NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元之間起信息傳遞作用，參與學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸傳遞及腦內(nèi)局部血流量的調(diào)節(jié)等許多生理過程[26]。NAHID等研究認(rèn)為海馬NO的合成對大鼠空間記憶的形成或許是一個很關(guān)鍵的因素[27]。PAUL等研究發(fā)現(xiàn)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶減退與海馬NOS活性降低及NO合成減少有關(guān)，注射L-精氨酸可以通過增加海馬NO的含量改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[28]。KIRCHNER等在水迷宮室驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)nNOS敲除的小鼠認(rèn)知功能顯著削弱[29]。

已有資料表明：大鼠學(xué)習(xí)記憶過程中其腦組織NO和NOS神經(jīng)元出現(xiàn)上調(diào)，衰老大鼠NO產(chǎn)生不足可能引起大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的衰退。本實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果，衰老對照組nNOS顯著減少，說明衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙至少部分是由于損害海馬一氧化氮合酶神經(jīng)元導(dǎo)致NO生成減少所致；而衰老運(yùn)動組大鼠游泳運(yùn)動8周后，海馬CA1、CA3、DG區(qū)內(nèi)nNOS陽性細(xì)胞及面積明顯增多。表明衰老大鼠長期游泳運(yùn)動提高學(xué)習(xí)記憶能力可能與海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，但海馬nNOS增強(qiáng)的機(jī)制仍不清楚?？赡苡捎陂L期游泳運(yùn)動使谷氨酸和鈣離子內(nèi)流，激活nNOS使海馬CA1、CA3、DG區(qū)NO增多。NO在誘導(dǎo)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的長時程增強(qiáng)（LTP）過程中起重要作用。研究認(rèn)為：nNOS對誘導(dǎo)海馬LTP是必需的，采用nNOS抑制劑7-硝基吲唑可阻斷LTP的形成[30]，長期游泳運(yùn)動激活nNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生NO[31]。NO作為逆向信使擴(kuò)散至突觸前膜使可溶型鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）活化，增加突觸前環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量，促進(jìn)突觸前谷氨酸（Glu）的釋放，谷氨酸再作用于突觸后N-甲基D天門冬氨酸（NMDA）受體，參與長時程增強(qiáng)現(xiàn)象（LTP）[32]；同時觸發(fā) Ca2+通道開放，Ca2+通過 NMDA 進(jìn)入胞內(nèi)與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合后活化NOS，NOS催化L-Arg再生成NO，從而對LTP的效應(yīng)起維持促進(jìn)作用。另有文獻(xiàn)表明：NO還可能通過調(diào)節(jié)多巴胺、乙酰膽堿等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[33]，及對腦血管的擴(kuò)血管作用從而增加腦血流量，參與學(xué)習(xí)記憶的過程[34]。有關(guān)長期運(yùn)動影響海馬nNOS陽性神經(jīng)元衰老變化的研究較少，以上推論還有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)衰老大鼠通過長期游泳運(yùn)動腦自由基SOD、GSH-px活性顯著上調(diào)，自由基MDA含量減少，大腦AchE活性顯著減弱，海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)目和面積均明顯增高。表明長期游泳運(yùn)動可能通過調(diào)節(jié)大腦自由基水平、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)活性、增強(qiáng)nNOS活性誘導(dǎo)LTP的形成，從而增強(qiáng)衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

（1）衰老大鼠大腦抗氧化能力顯著下降，中樞膽堿能系統(tǒng)AchE活性顯著增強(qiáng)，導(dǎo)致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。長期游泳運(yùn)動可提高衰老大鼠抗氧化能力，改善受損的中樞膽堿能系統(tǒng)，從而增強(qiáng)衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

（2）衰老大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)nNOS的表達(dá)顯著減少。長期游泳運(yùn)動可以增加海馬CA1、CA3及DG區(qū)nNOS的活性，增加NO的水平，從而增強(qiáng)衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

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