劉立萍，黃 蔚，唐序文，彭高英，劉 國，陳琳巧

(1.懷化市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，湖南 懷化 418000；

2.懷化市中方縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局質(zhì)量檢驗及計量檢定所，湖南 中方 418005)

高效液相色譜法測定食品中亮藍(lán)同分異構(gòu)體

劉立萍1，黃 蔚2，唐序文1，彭高英1，劉 國1，陳琳巧1

(1.懷化市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，湖南 懷化 418000；

2.懷化市中方縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局質(zhì)量檢驗及計量檢定所，湖南 中方 418005)

建立高效液相色譜法檢測食品中亮藍(lán)的新方法，初步證實(shí)食品中亮藍(lán)主要為3種異構(gòu)體的混合物。用聚酰胺層析柱凈化，高效液相色譜法分離。色譜柱為Inertsil ODS-SP C18 (150mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液，檢測波長629nm。加標(biāo)回收率為91.1%～94.7%。

亮藍(lán)同分異構(gòu)體；高效液相色譜；食品

食品色素是食品添加劑的重要組成部分，是食品工業(yè)不可缺少的原料之一。食品色素是以調(diào)節(jié)食品色澤為目的的重要食品添加劑，又稱食用染料或著色劑，分為天然色素和合成色素兩大類，其中，合成色素因色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、價格低廉等特點(diǎn)而被廣泛使用。最常用的有檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和亮藍(lán)5種，通常被混合使用；檢測方法上，目前大多數(shù)是5種色素同時檢測[1-12]。

亮藍(lán)(brilliant blue，分子結(jié)構(gòu)式見圖1)為非偶氮類酸性染料，主要有3個同分異構(gòu)體，主要為3個同分異構(gòu)體的混合物(間位磺化物:對位磺化物:鄰位磺化物＝75～85: 15～20:0～8)[13]。我國對允許使用的合成色素使用范圍和使用量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[14]，也規(guī)定了標(biāo)準(zhǔn)測定方法[15]，推薦了高效液相色譜法、薄層色譜法和示波極譜法，其中高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)的準(zhǔn)確度和靈敏度較高，所需儀器比較普及。

圖1 亮藍(lán)分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structural formula of Brilliant Blue

亮藍(lán)同分異構(gòu)體難以分離[13]，食品中亮藍(lán)檢測的研究報導(dǎo)很少涉及同分異構(gòu)體的情況，研究普遍認(rèn)為亮藍(lán)標(biāo)樣和食品中亮藍(lán)為單一峰的純品，以單一峰面積定量，食品中亮藍(lán)為同分異構(gòu)體的混合物還未見報道。在多種色素同時測定時，如不對亮藍(lán)及其異構(gòu)體加以分離辨認(rèn)，會對其他色素的測定存在干擾。本研究用層析柱凈化、反相高效液相色譜法分離，測定食品中亮藍(lán)，實(shí)現(xiàn)了3種同分異構(gòu)體的分離，以異構(gòu)體組合峰面積準(zhǔn)確定量。方法簡單可靠，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫葡萄果味飲料、米花糖、綠豆餅、青蘋果飲料、糖果、果凍由湖南省懷化市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所提供；聚酰胺粉(粒徑0.075～0.15mm) 浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠； 0.45μm無機(jī)濾膜；玻璃層析柱(2cm×30cm，配有燒結(jié)玻璃墊和聚四氟乙烯旋塞)。

亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)，編號100005a，批號08002：0.5mg/mL]儀表 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；水為超純水；溶液為水溶液；甲醇為色譜純；所用試劑，除另有規(guī)定外，均為分析純試劑。

0.02mol/L乙酸銨溶液、甲醇-甲酸(6:4，V/V)混合溶液、乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1，V/V)、50g/100mL檸檬酸溶液、220g/L乙酸鋅溶液、106g/L亞鐵氰化鉀、5g/100mL氫氧化鈉溶液、體積分?jǐn)?shù)10%乙酸溶液。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(配二級管陣列檢測器) 日本島津公司；TC16-Ⅱ高速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；真空泵。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18(150mm×4.6mm，5μm)日本島津公司；柱溫：25℃；流動相：甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(45:55，V/V)；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測波長629nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用超純水配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，在設(shè)定的色譜條件下，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 聚酰胺樹脂預(yù)處理

取聚酰胺，用90%～95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3～4倍體積的90%～95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣(或極少殘渣)。再依次用2～3倍體積5g/100mL氫氧化鈉、3～4倍體積的蒸餾水、2～3倍體積的10%乙酸洗脫，最后用蒸餾水洗脫至pH值中性，105℃條件干燥，備用。

1.2.4 聚酰胺粉層析柱裝配

將洗凈的層析柱固定，關(guān)閉活塞。稱取經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺粉2～3g(稱準(zhǔn)至0.01g)于100mL的小燒杯，加適量的水，用玻璃棒攪拌片刻，然后邊攪拌邊裝入層析柱中，用水洗下柱內(nèi)壁的樹脂，最后用洗耳球輕敲層析柱，使樹脂層高度為3cm左右，并且較為緊密，打開旋塞，使水流出到樹脂頂部約0.5～1cm，關(guān)閉旋塞。層析柱出口與抽濾瓶(1000mL，配一單孔橡膠塞，孔中插一玻璃導(dǎo)管)的導(dǎo)管、抽濾瓶與真空泵之間均用硅膠管連接，形成完整的抽濾系統(tǒng)。

1.2.5 色素提取

液態(tài)樣品：準(zhǔn)確稱取10～20g(精確到0.0001g)均勻的試樣于50mL比色管(如為碳酸飲料和酒精飲料，則把盛有試樣的比色管置于沸水浴中去除二氧化碳和酒精)，用50g/100mL檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH4～5，水定容至刻度，搖勻，備用。

糖果和果凍：準(zhǔn)確稱取5g(精確到0.0001g)粉碎并且均勻的試樣于50mL比色管，加40mL水，置70℃水浴溶解，冷卻后定容至刻度，搖勻，離心(6000r/min以上)，用濾紙干過濾，準(zhǔn)確取20mL濾液于100mL小燒杯，用50g/100mL檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH4～5。

其他固體樣品：準(zhǔn)確稱取5g(精確到0.0001g)粉碎并且均勻的試樣于50mL比色管(如油脂含量高，用石油醚預(yù)先除去)，加入40mL乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1)，混勻并超聲20min，室溫靜置10min，定容至刻度，搖勻，離心(6000r/min以上)，用濾紙干過濾，準(zhǔn)確取20mL濾液于100mL小燒杯，用50g/100mL檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH4～5。

1.2.6 色素凈化

準(zhǔn)確取20mL樣品提取液，移入層析柱，用水洗層析柱內(nèi)壁；打開旋塞，啟動真空泵，使色素吸附到樹脂上，形成一個色素環(huán)帶，用甲酸或檸檬酸調(diào)水pH值為pH4～5，洗滌3～5次，除去水溶性雜質(zhì)，關(guān)閉真空泵，棄去洗滌廢液；在抽濾瓶中放一支25mL的比色管，用來接收解吸液；連接并啟動真空泵，用乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1)解吸樹脂上的色素，解吸3次，每次5～6mL；關(guān)閉真空泵，倒出解吸液于50mL蒸發(fā)瓶，揮發(fā)至干，加水2mL，把殘渣充分溶解，用無機(jī)濾膜過濾，濾液供分析用。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理條件的選擇

樣品基質(zhì)復(fù)雜，在試液中分別加2mL沉淀劑乙酸鋅(220g/L)和亞鐵氰化鉀(106g/L)，雖然試樣液變澄清，但絮狀沉淀物對色素有吸附作用，經(jīng)對比試驗發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果偏低，所以選澤不加沉淀劑。

用聚酰胺層析柱處理試樣的方法比GB/T 5009.35— 2003《食品中合成著色劑的測定》優(yōu)越。用聚酰胺層析柱吸附色素，得到色素環(huán)帶，現(xiàn)象直觀；把聚酰胺樹脂加到基質(zhì)復(fù)雜的試樣中，吸附色素，用G3漏斗抽濾，容易產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象；試樣在層析柱中用甲醇-甲酸混合溶液(6:4，V/V)凈化，發(fā)現(xiàn)亮藍(lán)有流失現(xiàn)象，所以不用甲醇-甲酸混合溶液(6:4，V/V)凈化試樣，僅用pH4～5的水洗3～5次，除去水溶性雜質(zhì)，然后用乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1，V/V)解吸樹脂上的亮藍(lán)，解吸時，環(huán)形色帶向下迅速移動，直到色素完全被洗脫和收集，現(xiàn)象明顯，操作方便。

2.2 流動相的選擇

以0.05mg/mL的亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品為研究對象，比較乙腈-0.02mol/L乙酸銨溶液和甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液兩個流動相組合，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液組合對亮藍(lán)分離效果好。固定柱箱溫度25℃、流速1.0mL/min和最大吸收波長629nm三個條件，改變流動相比例對亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行分離。當(dāng)流動相甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液體積比為45:55時，在30min內(nèi)，只有緊鄰的3個峰，見圖2，峰形好，峰純度指數(shù)均為1.0，3個峰對應(yīng)的光譜圖完全相同，見圖3。因為亮藍(lán)3個異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)非常相似，因此，初步認(rèn)為3個峰相應(yīng)的組分是亮藍(lán)的3個同分異構(gòu)體。依據(jù)文獻(xiàn)[13]，峰面積最大的峰3應(yīng)該是間位磺化物，峰2是對位磺化物，峰1是鄰位磺化物。根據(jù)所得峰面積計算，峰3:峰2:峰1＝76:21:3，與文獻(xiàn)[5]報道的含量范圍相符。當(dāng)甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(50:50，V/V)時，3個峰之間有一定的重疊；當(dāng)甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(40:60，V/V)時，雖然3個峰之間分離好，但出峰時間推遲，峰形展寬。所以甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(45:55，V/V)為最佳流動相，并在此條件下進(jìn)行樣品測定，樣品色譜圖(圖4)說明目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離好，通過與標(biāo)樣光譜圖比較，峰1、2、3為亮藍(lán)的3個同分異構(gòu)體，用二極管陣列(diode array detector，DAD)光譜圖定性，以異構(gòu)體組合峰面積準(zhǔn)確定量。

圖2 亮藍(lán)標(biāo)樣色譜圖Fig.2 Chromatogram of brilliant blue standard

圖3 亮藍(lán)標(biāo)樣光譜圖Fig.3 UV-visible absorption spectrum of brilliant blue standard

圖4 紫葡萄果味飲料色譜圖Fig.4 Chromatogram of purple grape fruity drink

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度在0.01～0.05mg/mL時，質(zhì)量濃度和同分異構(gòu)體組合峰面積有良好的線性關(guān)系(圖5)，線性回歸方程為y＝88194762.9x－21510.2，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9995，同時做空白試驗，檢出限以對應(yīng)于峰1、2、3處噪音面積和的3倍計算，方法檢出限為0.00004g/kg。說明方法靈敏。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗

按照1.2.5節(jié)、1.2.6節(jié)樣品處理方法和1.2.1節(jié)色譜條件，以亮藍(lán)標(biāo)樣3個同分異構(gòu)體的組合峰面積進(jìn)行定量，DAD光譜圖定性，對6個樣品(葡萄果味飲料、米花糖、綠豆餅、青蘋果飲料、糖果、果凍)進(jìn)行測定，結(jié)果表明葡萄果味飲料、綠豆餅、青蘋果飲料、糖果和果凍檢出亮藍(lán)，含量分別為0.0113、0.0010、0.0009、0.0027g/kg和0.0010g/kg，米花糖未檢出亮藍(lán)；對葡萄果味飲料和綠豆餅平行測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為2.3%和3.2%，同時以米花糖為加標(biāo)基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗，加標(biāo)水平分別為0.01、0.02、0.03mg/mL，平行測定2次，每個水平平均回收率分別為91.1%、94.7%和94.2%。結(jié)果說明方法準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

本研究對GB/T 5009.35—2003進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，初步證實(shí)食品著色劑亮藍(lán)和國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提供的標(biāo)樣主要為3種異構(gòu)體的混合物，并不是單一的結(jié)構(gòu)；建立了高效液相色譜法有效測定食品中亮藍(lán)同分異構(gòu)體的新方法。用聚酰胺層析柱凈化，高效液相色譜法分離；以DAD光譜圖定性，亮藍(lán)標(biāo)樣異構(gòu)體組合峰面積定量，對樣品進(jìn)行檢測。該方法簡單可靠、準(zhǔn)確可行，結(jié)果令人滿意。亮藍(lán)同分異構(gòu)體的分離純化，以及其相應(yīng)的毒理學(xué)問題有待進(jìn)一步研究。

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[15] GB/T 5009.35—2003 食品中合成著色劑的測定[S].

Determination of Brilliant Blue Isomers in Food by High Performance Liquid Chromatography

LIU Liping1，HUANG Wei2，TANG Xu-wen1，PENG Gao-ying1，LIU Guo1，CHEN Lin-qiao1

(1. Institute of Product and Commodity Quality Inspection and Supervision, Huaihua Quality and Technical Supervision Bureau, Huaihua 418000, China；2. Institute of Quality Inspection and Measurement Calibration, Zhongfang County Bureau of Quality and Technical Supervision, Zhongfang 418005, China)

A new analytical method was developed for the determination of brilliant blue in food by high performance liquid chromatography (HPLC). It was preliminarily confirmed that the presence of brilliant blue in food was mixtures of its three isomers. Sample extracts were purified by polyamide column chromatography and separated on an Inertsil ODS-SP C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) column using a mobile phase made up of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate solution. The detection wavelength was set as 629 nm. The spike recovery rates across three spike levels were in the range of 91.1%－94.7%. The method was simple and accurate.

brilliant blue isomers；high performance liquid chromatography (HPLC)；food

O658

A

1002-6630(2012)08-0221-04

2011-04-18

劉立萍(1966—)，女，高級工程師，本科，主要從事食品質(zhì)量安全檢驗和天然產(chǎn)物研究。E-mail：llp3585366@163.com