黃 會，宮向紅，劉慧慧，徐英江，李佳蔚，張秀珍,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋水產(chǎn)研究所，山東 煙臺 264006；

3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006；4.煙臺山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264006)

柱前衍生高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量

黃 會1，宮向紅2,3，劉慧慧2,3，徐英江2,3，李佳蔚4，張秀珍2,3,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋水產(chǎn)研究所，山東 煙臺 264006；

3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室，山東 煙臺 264006；4.煙臺山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264006)

建立水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量的柱前衍生高效液相色譜測定方法。樣品經(jīng)酸水解，丹酰氯衍生，C18柱分離，紫外檢測器檢測。結(jié)果表明，羥脯氨酸與其他氨基酸較好分離，在0.5～20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r＞0.9999)，檢出限0.5μg/mL，平均回收率80.2%～103%，RSD范圍3.2%～5.6%。該方法靈敏、準確，適用于水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量的測定。

羥脯氨酸；丹酰氯；柱前衍生；高效液相色譜法；水產(chǎn)品

膠原蛋白主要存在于動物的皮、骨、軟骨、肌腱、韌帶和血管中，是結(jié)締組織中極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護肌體的重要作用。羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是膠原蛋白的特異性氨基酸，在其他蛋白質(zhì)中很少見[1]，而且其在膠原蛋白中含量穩(wěn)定，占總氨基酸的10%～14%；在膠原蛋白的生物合成過程中，沒有游離的Hyp參與合成，所有的Hyp均由已合成的肽鏈中的脯氨酸經(jīng)羥化酶作用轉(zhuǎn)化而來，因而可通過測定Hyp計算膠原蛋白的含量。此外，最新研究表明，膠原蛋白水解所得的膠原肽具有很好的吸收特性[2]，而且還具有許多生理活性[3-4]，而這些生理活性大多與L-Hyp有關(guān)。因此Hyp測定在實際應(yīng)用中非常重要。

傳統(tǒng)的測定Hyp的方法是比色法[5-8]，其操作步驟繁瑣，影響因素多，樣品需要量大，且特異性、靈敏度差。與比色法相比，氨基酸自動分析法[9]是一種快速、準確、靈敏度高的測定方法，但其費用高，普通實驗室很少配備。而高效液相色譜儀普及率較高，且柱效高，靈敏度和精密度良好，近年來廣泛用于氨基酸的分析測定[10-15]。本實驗利用丹酰氯對Hyp進行柱前衍生，建立測定水產(chǎn)品中Hyp含量的反相高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚、蝦、海參樣品購自當?shù)厮a(chǎn)品市場。魚去頭、去皮、去內(nèi)臟；蝦去頭、去殼；海參去沙嘴、內(nèi)臟；以上處理樣品分別取可食部分充分勻漿，－18℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

碳酸氫鈉、無水乙酸鈉、鹽酸、丙酮為分析純；甲醇、四氫呋喃為色譜純；水為超純水。

L-羥脯氨酸(L-Hyp，純度99%)標準品(中國J&K Chemical公司)，采用超純水配成質(zhì)量濃度1.00g/L的標準貯備液，于4℃保存，臨用時，用水逐級稀釋成為適當濃度的標準工作液；丹酰氯(dansyl chloride，98%，美國Acros Organics公司)，稱取0.04g丹酰氯，用丙酮溶解，并定容至10mL，4℃避光保存，有效期3d。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀(配2996 PDA檢測器) 美國Waters公司；FA25勻漿機 上海Fluko公司；XW-80A漩渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；101-2A恒溫干燥箱 上海陽光實驗儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品水解

稱取適量勻漿后的樣品于水解管中，使每管中含蛋白質(zhì)約20mg，加入6mol/L鹽酸溶液6mL，充氮氣1min，抽真空至管內(nèi)鹽酸輕微起泡，用火焰將管封住。于110℃水解22h，冷卻后，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，加水至刻度?；靹蚝?，取1mL水解液于10mL容量瓶中，加2mol/L氫氧化鈉溶液400μL，加水稀釋至刻度。取1mL稀釋液用0.45μm濾膜過濾備用。

1.3.2 衍生

取過濾后的稀釋液500μL于5mL具塞離心管中，加飽和碳酸氫鈉溶液200μL，衍生試劑400μL，漩渦混勻30s，80℃水浴中避光反應(yīng)45min，取出迅速冷卻，加入1mol/L鹽酸400μL終止反應(yīng)，用0.45μm濾膜過濾，供高效液相色譜分析。

1.3.3 液相色譜條件

MG C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫40℃；檢測波長254nm；進樣量20μL。流動相A為甲醇，B為四氫呋喃-甲醇-0.05mol/L乙酸鈉溶液(1:15:84，V/V)；梯度洗脫程序見表1，流速1.0mL/min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生條件的選擇

丹酰氯可以同伯胺或仲胺基上的活潑氫反應(yīng)，脫掉一分子的HCl生成具有熒光和紫外吸收的衍生物，常用于氨基酸以及生物胺類的檢測[15]。在這一反應(yīng)過程中，衍生試劑的濃度、緩沖溶液、反應(yīng)溫度和時間是關(guān)鍵影響因素。

2.1.1 衍生試劑質(zhì)量濃度的選擇

本研究探討衍生試劑濃度對衍生效果的影響，分別配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液，取一定量的Hyp標準溶液，按1.3.2節(jié)方法衍生，每個質(zhì)量濃度點做3個平行，結(jié)果表明隨著衍生試劑質(zhì)量濃度的增加，Hyp衍生物的生成量增加，當?shù)Ｂ荣|(zhì)量濃度達到3mg/mL時衍生產(chǎn)物的生成量趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加丹酰氯的濃度，衍生產(chǎn)物的生成量不再增加。為了保證衍生反應(yīng)的順利進行，既要使衍生試劑足量，又要減少不必要的浪費，本研究選用4mg/mL作為丹磺酰氯的衍生質(zhì)量濃度。

2.1.2 衍生反應(yīng)溫度和時間的確定

該衍生反應(yīng)在常溫和加熱條件下均能發(fā)生。本研究探討溫度和反應(yīng)時間對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)溫度和時間對結(jié)果的影響Fig.1 Effect of reaction temperature and time on peak height

由圖1可見，隨著衍生反應(yīng)時間的增加，衍生產(chǎn)物的生成量均隨之增加，反應(yīng)時間超過45min時，生成量趨于穩(wěn)定。隨著衍生反應(yīng)溫度的升高，衍生化產(chǎn)物也呈增加的趨勢，因此本研究確定衍生反應(yīng)溫度80℃、反應(yīng)時間45min。

2.1.3 衍生反應(yīng)體系的pH值

衍生反應(yīng)要在堿性條件下才能發(fā)生。本實驗選取飽和碳酸氫鈉緩沖溶液體系，可保證衍生反應(yīng)順利進行，且飽和碳酸氫鈉溶液配制也較簡單，便于操作。

2.2 衍生試劑溶液及衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性實驗

配制4mg/mL衍生試劑溶液，于4℃避光保存，每天用10μg/mL Hyp標準溶液按1.3.2節(jié)方法衍生測定，觀察響應(yīng)值的變化。結(jié)果表明，第4天開始響應(yīng)值降低，因此衍生試劑溶液在4℃避光條件下有效期為3d。

將上述衍生好的Hyp標準溶液于室溫下避光保存，每天進樣分析，觀察響應(yīng)值的變化。結(jié)果表明，Hyp衍生產(chǎn)物在5d內(nèi)峰形和峰面積無明顯變化。

2.3 色譜分離

2.3.1 色譜柱的選擇

對MG C18、ODS-3和ODS-DABS三種色譜柱的分離效果進行評估，發(fā)現(xiàn)ODS-DABS柱不能把Hyp與雜質(zhì)完全分離，而MG C18柱和ODS-3柱雖然均可實現(xiàn)基質(zhì)和分析物的分離，但是ODS-3柱保留時間延長了2min，且峰形較寬，而MG C18柱的峰形尖銳，分離度良好，因此本方法采用MG C18柱作為分析柱。

2.3.2 流動相的選擇

圖2 Hyp標準溶液(10μg/mL)(A)和海參樣品(B)色譜圖Fig.2 Chromatograms of 10μg/mL Hyp standard solution and sea cucumber sample

水產(chǎn)品水解液中的氨基酸類物質(zhì)是柱前衍生法測定Hyp的最大干擾，流動相的pH值和離子強度都會影響目標峰與干擾峰的分離，采用不同比例的甲醇-水、乙睛-水難以將其與樣品中的雜質(zhì)分離，因此必須采用緩沖溶液作為流動相。本研究采用流動相A：甲醇；流動相B：四氫呋喃-甲醇-0.05mol/L乙酸鈉溶液(1:15:84)，進行梯度洗脫，使目標物與基質(zhì)完全分離。四氫呋喃的加入有效地改善了峰形和分離度。用乙腈代替甲醇并改變其比例進行實驗，在1.0mL/min流速下洗脫，Hyp不能與雜質(zhì)完全分離，且靈敏度不及甲醇，因此本實驗采用甲醇做有機相。

在本研究建立的色譜條件下，羥脯氨酸峰形對稱、尖銳，沒有雜峰干擾。Hyp標準溶液和海參樣品色譜圖見圖2。

2.4 標準曲線

取標準貯備液，用水逐級稀釋至0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μg/mL，分別取500μL于5mL具塞離心管中，按1.3.2節(jié)方法衍生，測定。以Hyp質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，對應(yīng)的峰高為縱坐標(y)，繪制標準曲線?；貧w方程：y＝5.07×103x＋8.43×102，r＞0.9999，表明在0.5～20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 檢出限、回收率和精密度

以RSN＝3計，本方法檢出限0.5μg/mL。

向海參樣品中添加Hyp 50、100、150mg/g，每組做6個平行樣品，進行回收率和精密度實驗。結(jié)果表明，Hyp的平均回收率為80.2%～103%，RSD為3.2%～5.6%，說明方法精密度良好。結(jié)果見表2。

表2 方法的加標回收率和相對標準偏差Table 2 Spike recovery rates and relative standard deviations for Hyp determination in sea cucumber sample

3 結(jié) 論

本實驗采用酸水解、丹酰氯柱前衍生法，有效將樣品中羥脯氨酸解離并衍生為有紫外吸收的羥脯氨酸衍生物。采用高效液相色譜分離，紫外檢測器檢測，建立了水產(chǎn)品中羥脯氨酸的檢測方法。該方法靈敏、準確，精密度高，適用于水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量的分析測定。

[1] 沈同, 王鏡巖, 趙邦悌, 等. 生物化學(xué): 上冊[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 1991: 154-160.

[2] 樊繪曾. 海參: 海中人參: 關(guān)于海參及其成分保健醫(yī)療功能的研究與開發(fā)[J]. 中國海洋藥物, 2001, 20(4): 37-44.

[3] 劉慶慧, 王彩理, 劉叢力, 等. 魚鱗膠原蛋白研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2000, 21(3): 57-60.

[4] 張心如. 膠原蛋白食品倍受青睞[J]. 中國保健營養(yǎng), 2003(7): 32-34.

[5] GB/T 9695.23—2008 肉與肉制品: L(-)羥脯氨酸含量測定[S].

[6] 張俊杰, 段蕊, 曾慶孝. 鯉魚鱗中羥脯氨酸測定的影響因素[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(1): 191-195.

[7] 趙天珍, 袁秀金, 譚貴良, 等. 比色法快速測定奶粉盒乳飲料中游離L-羥脯氨酸[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29(12): 111-113.

[8] 張笑, 劉杰, 陳翠嵐. 比色法測定明膠中的L-羥脯氨酸[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2010, 27(3): 124-127.

[9] 鄭比杏, 周云. 用氨基酸自動分析儀分析色氨酸方法研究[J]. 廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1994, 13(2): 167-172.

[10] 田靜, 呂堅. 高效液相色譜法測定大鼠纖維化肝組織中羥脯氨酸含量[J]. 中國藥房, 2003, 14(3): 145-147.

[11] 崔勇, 劉智, 張博, 等. 反相高效液相色譜柱前衍生法測定保健食品中羥脯氨酸的含量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(11): 2247-2248.

[12] 胡華. 羥脯氨酸的測定及其在醬油摻假鑒定和總的應(yīng)用[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2010.

[13] 鄒曉莉, 黎源倩, 曾紅艷, 等. 反相高效液相色譜法測定人肌腱中的膠原蛋白[J]. 色譜, 2006, 24(3): 263-266.

[14] 夏金根, 陳波, 姚守拙. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定膠原蛋白中的羥脯氨酸[J]. 色譜, 2008, 26(2): 595-598.

[15] 董偉峰, 李憲臻, 林維宣. 丹磺酰氯作為生物胺柱前衍生試劑衍生化條件的研究[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2005, 24(2): 115-118.

Determination of Hydroxyproline in Fishery Products by Pre-Column Derivatization-High Performance Liquid Chromatography

HUANG Hui1，GONG Xiang-hong2,3，LIU Hui-hui2,3，XU Ying-jiang2,3，LI Jia-wei4，ZHANG Xiu-zhen2,3,*

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；
2. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province, Yantai 264006, China；
3. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Yantai 264006, China；
4. Yantai Shanshui Seafood Co. Ltd., Yantai 264006, China)

A high performance liquid chromatographic method was established for the determination of hydroxyproline in fishery products with pre-column derivatization. Samples were hydrolyzed with hydrochloric acid before pre-column derivatization with dansyl chloride. The analyze was separated using a C18 column and detected using a UV detector. Good separation was achieved for hydroxyproline and other amino acids. The linear range was 0.5－20 μg/mL (r ＞ 0.9999). The detection limit was 0.5 μg/mL. The average spike recovery rates were 80.2%－103% with a RSD of 3.2%－5.6%. The method was sensitive, accurate and suitable for the determination of hydroxyproline in fishery products.

hydroxyproline；dansyl chloride；pre-column derivatization；HPLC；fishery products

O657.72

A

1002-6630(2012)08-0207-04

2011-04-22

山東省水生動物營養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位資助項目；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(200805031；200905019；201105013)

黃會(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：hh57319@126.com

*通信作者：張秀珍(1964—)，女，研究員，本科，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：zxz0535501@126.com