劉鵬翀，黃金海,*，劉 莉，劉 瑩，劉 壯，孫 盈

(1.天津大學化工學院，天津 300072；2.天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381)

葡萄球菌腸毒素DAS-ELISA檢測方法的建立及應用

劉鵬翀1，黃金海1,*，劉 莉1，劉 瑩1，劉 壯2，孫 盈1

(1.天津大學化工學院，天津 300072；2.天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381)

為篩選特異性強、親和力高、可夾心配對單克隆抗體4A2和5C12，通過方陣試驗優(yōu)化工作條件，建立金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)的雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測方法。結果表明：該方法標準曲線為y＝4.074x－1.1888，R2＝0.9892，檢測下限為0.307μg/mL，批內和批間變異系數(shù)均小于10%，脫脂乳粉中SEs摻入試驗測定回收率為103%～107%，特異性、重復性和穩(wěn)定性良好；應用所建雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，對數(shù)株葡萄球菌分離株體外培養(yǎng)上清中SEs產(chǎn)生的動態(tài)變化進行分析表明，不同菌株SEs分泌能力不同，且0～20h分泌量不斷增加，對鮮牛乳和豬淋巴組織勻漿中的SEs進行檢測，檢出率分別為51.7%和59.1%，并與進口商品化試劑盒檢測結果比對，一致率達92.5%，表明食品中SEs污染的普遍存在。所建方法靈敏高效，可為食源性污染監(jiān)控提供有效手段。

葡萄球菌；葡萄球菌腸毒素；雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附法；檢測方法

葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是由血漿凝固酶或耐熱核酸酶陽性菌株產(chǎn)生的一類結構相關、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質[1]。迄今，血清型鑒定明確的SEs除傳統(tǒng)分類的SEA、SEB、SEC、 SED、SEE、SEF(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)外， SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEM、SEN等新型腸毒素隨研究的深入而不斷被發(fā)現(xiàn)[2]。SEs已被認為是第二大細菌毒素[3]，每100g食物中含有18μg既能引發(fā)中毒，是引起人類疾病和細菌性食物中毒的主要致病因子，為世界性衛(wèi)生問題[4]。建立食品原料中SEs的快速靈敏檢測方法對臨床診斷、預防SEs引起的食物中毒具有實際意義，也有助于開展對新型腸毒素蛋白結構、功能等的理論研究。

目前，SEs檢測的酶聯(lián)免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)仍是應用最廣泛、可信度較高的方法，但目前普遍采用多抗，故具有存在交叉反應、靈敏度不足等缺陷，使得SEs的檢測難于定量，不能滿足新型腸毒素檢測的需求。本研究通過篩選特異性強、親和力高、可夾心配對的單抗，建立雙抗體夾心(double antibody sandwich，DAS)-ELISA定量檢測SEs方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬淋巴組織勻漿樣本110份，采集于天津市屠宰場，－40℃凍存；鮮牛乳樣本120份，由天津市乳品監(jiān)測中心提供。

SEA抗原標準品 軍事醫(yī)學科學院微生物學研究所；SEA-His、SEK-His、SEO-His、SEG-His、SEUHis重組抗原、抗SEA單克隆抗體 4A2、7G5，抗SEO單克隆抗體8C7、5C12腹水 自制；葡萄球菌分離株PMJ 28-1(sea)、JIN 2(sek)、PMJ24-3(seo)、PYN1-3 (seg、sem、sen、seo)、ZNZ2-3(攜帶腸毒素sea、sec、sed、tsst、seg、she、sei、sem、sen、ser、seu基因)、JI 1-1(未攜帶腸毒素基因)(括號內為菌株攜帶腸毒素基因)由本實驗室保存；金黃色葡萄球菌腸毒素總量檢測試劑盒(RIDASCREEN SET Total) 德國R-Biopharm公司。其余常規(guī)試劑均為分析純。

96孔酶標板 美國Costa公司；DNM-9602酶標儀北京普朗新技術公司；Fossomatic 5000體細胞分析儀 北京福斯佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體的制備與標記

飽和硫酸銨法分別純化4A2、7G5、8C7和5C12腹水，紫外吸收法測定蛋白濃度。間接ELISA法測定純化抗體效價，按Beatty推導公式計算相對抗體親和力[5]。選取效價高、親和力較強的單抗，Wilson改良過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記。標記物(HRP-McAb)采用直接ELISA方法進行抗體活性鑒定。

1.2.2 DAS-ELISA方法的建立

將除HRP標記用抗體外的其余株單抗作1:100稀釋包被，分別與HRP標記單抗進行配伍組合，以選擇最佳夾心配對抗體。再將最佳包被抗體分別作1:50、1:100、1:200、1:400稀釋包被，SEA-His重組蛋白作為抗原，并按1:40、1:80、1:160、1:320稀釋進行實驗，采用交叉方陣滴定法[6]，篩選、確定包被抗體與抗原最佳工作質量濃度；同時對封閉液種類和質量濃度、酶標抗體工作質量濃度、顯色時間等反應條件進行優(yōu)化，確定最佳的檢測體系。

1.2.3 標準曲線測定

按照已確定的最佳反應條件進行ELISA檢測，以SEA純品及SEA-His為陽性樣品，從10μg/mL起進行“2×”倍比稀釋至0.078μg/mL，各組重復3孔。分別以OD450值為橫坐標、對應抗原質量濃度的常用對數(shù)(lg CSEs)為縱坐標，獲得線性區(qū)段標準曲線方程，并計算天然腸毒素檢測下限。在線性檢測范圍為內分別將SEA-His、SEK-His、SEO-His、SEG-His、SEU-His進行“2×”倍比稀釋，繪制回歸曲線。

1.2.4 特異性、重復性、穩(wěn)定性實驗

大腸埃希氏菌腸毒素為食品常見污染物，將大腸埃希氏菌LB過夜培養(yǎng)物12000r/min離心2min取上清液，應用DAS-ELISA方法進行檢測。同時設檢測質量濃度為5、2.5、1.25μg/mL的SEA-His陽性、空白培養(yǎng)基陰性對照。每組重復12孔，t檢驗分析所建立方法的特異性及批內變異系數(shù)。將制備的不同批次的酶標板于4℃放置1、3、7、10d后，檢測同一SEA-His陽性樣品，每組重復12孔，計算批間變異系數(shù)。

1.2.5 DAS-ELISA方法檢測樣品中腸毒素

6株葡萄球菌分離株天然SEs分泌的動力學分析：將不同葡萄球菌分離株單菌落分別接種10mL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)(120r/min)12h，獲得種子液。分別取種子液按體積分數(shù)1%接種50mL腦心浸液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)(120r/min)20h。發(fā)酵過程中，0～9h內每小時取樣1mL，10～20h每2h取樣1mL，樣本于4℃、12000r/mim離心5min，留取上清液，即為天然SEs粗提取液。利用DASELISA體系檢測6種葡萄球菌產(chǎn)毒動態(tài)變化。

鮮牛乳、豬肉組織中SEs檢測：稱取5g SEs檢測陰性脫脂乳粉溶于95mL蒸餾水配制成5%脫脂乳液，煮沸30min后分別加入高(20μg/mL)、中(5μg/mL)、低(1.25μg/mL)不同劑量的SEA-His，混合后12000r/min離心2min，取上清液，按建立檢測程序測定，計算平均回收率。采集天津地區(qū)120份鮮牛乳，應用體細胞分析儀測定體細胞數(shù)，同時取1mL樣品12000r/min離心2min，取水相上清作待測樣品。采集天津地區(qū)110份豬肉淋巴結，分別稱取1g組織樣本，加入5mL PBS勻漿后4℃、12000r/min離心5min，取上清液作待測樣品。采用DASELISA方法對上述樣品進行檢測，并隨機抽取40份樣品應用RIDASCREEN SET Total試劑盒檢測，比較檢測結果的一致性。

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體純化與標記

4A2、7G5、8C7和5C12四株純化單抗含量分別為4.50、8.92、9.25、6.27mg/mL，效價為1:5120～1:10240，相對親和常數(shù)均大于6.612×108L/mol。選用效價及抗原結合能力相對較佳的5C12株單抗對其進行HRP標記，結合率為0.831。經(jīng)直接ELISA測定，HRP-5C12在1:6400稀釋時，結果仍為陽性。

2.2 DAS-ELISA方法建立及優(yōu)化

分別以4A2、7G5、8C7純化抗體作為捕獲抗體，HRP-5C12作為檢測抗體，進行夾心配對。選取P/N值最高且本底值較低的配對為最佳配伍組合(圖1)。

圖1 3株單抗夾心配對結果Fig.1 Results of sandwich matching for three McAbs

確立DAS-ELISA方法最佳工作條件為：4A2株單抗稀釋至4.5、100μL/孔，4℃過夜包被；體積分數(shù)5%豬血清為封閉液；HRP-5C12工作濃度1:160。

2.3 標準曲線測定

圖2 SEA標準曲線Fig.2 Standard curve of SEA

應用確定的DAS-ELISA反應程序檢測SEA-His系列稀釋樣品，繪制腸毒素質量濃度常用對數(shù)與OD值之間的反應回歸曲線，結果見圖2，結果表明SEA-His在0.312～10μg/mL范圍內呈現(xiàn)明顯的劑量效應關系，DASELISA檢測OD450(x)與腸毒素含量常用對數(shù)lg CSEA(y)之間的回歸方程為y＝4.074x－1.1888，R2＝0.9892，計算可知所建方法對天然腸毒素檢測下限為0.307μg/mL。

在0.307～10μg/mL檢測線性范圍內，分別檢測SEAHis、SEK-His、SEO-His、SEG-His、SEU-His倍比稀釋樣品，結果見圖3。5種SEs-His及天然腸毒素SEA回歸曲線線性關系良好，斜率相近，表明選用SEA-His建立的DAS-ELISA方法識別天然腸毒素SEA外，同時能夠檢測包括SEG、SEK、SEO、SEU在內多種血清型腸毒素，所用單抗具備群特異性，能滿足食品中多型SEs檢測的要求。

圖3 SEs-His及SEA回歸曲線Fig.3 Comparison of the regression curves of SE-His and SEA

2.4 特異性、重復性與穩(wěn)定性實驗

同時檢測大腸埃希氏菌培養(yǎng)上清液及空白培養(yǎng)基，OD450分別為0.102±0.009、0.096±0.011，t檢驗(P＞0.05)，表明檢測方法與大腸埃希氏菌培養(yǎng)物無交叉反應。對不同含量SEs樣品檢測的批內變異系數(shù)在2.319%～3.746%、不同批次檢測試劑盒對相同樣品檢測的批間變異系數(shù)為6.140%～10.251%，表明檢測方法具有較好的重復性和穩(wěn)定性。

2.5 DAS-ELISA方法的初步應用

模擬葡萄球菌產(chǎn)生SEs培養(yǎng)環(huán)境，應用建立的DASELISA體系檢測6株葡萄球菌腸毒素產(chǎn)生的動態(tài)變化，分別以培養(yǎng)時間為橫坐標、OD450為縱坐標，繪制動態(tài)曲線如圖4所示。結果表明，不同菌種產(chǎn)毒能力不同，除菌株JI1-1培養(yǎng)20h時接近陰陽性臨界值，其余菌株在此培養(yǎng)條件下6～8h均有天然腸毒素檢出，且隨培養(yǎng)時間延長遞增趨勢明顯。

圖4 6株葡萄球菌SEs分泌動態(tài)曲線Fig.4 Dynamic curves of SE secretion by different isolates

檢測添加不同劑量SEA-His脫脂乳中毒素，實測值與理論值間符合率良好，回收率接近100%。表1所示，SEs具有良好的親水性，離心處理不影響奶樣中SEs的全量檢出。

表1 脫脂乳腸毒素摻入實驗結果Table 1 Recovery rates of DAS-ELISA for milk samples spiked with ES

對120份鮮牛乳樣品中SEs進行檢測(表2)，陽性檢出率為51.7%。與體細胞數(shù)檢測結果比較，其中體細胞數(shù)超標(＞5×10個/mL)且SEs陽性檢出的樣品55份，體細胞數(shù)正常且SEs陰性檢出的樣品28份，附合率達69.7%(83/120)，表明SEs陽性與其體細胞超標可能存在一定相關性。110份豬淋巴結中SEs檢測結果(表3)顯示，腸毒素在淋巴結中有較高的檢出率59.1%。隨機抽取40份樣品，自建DAS-ELISA方法與RIDASCREEN SET Total試劑盒檢測結果比對，一致率為92.5%。

表2 天津地區(qū)120份生鮮牛乳樣本中腸毒素檢測結果Table 2 Detection results of ES in 20 fresh milk samples by DAS ELISA

表3 天津地區(qū)110份豬淋巴組織樣品中腸毒素檢測結果Table 3 Detection results of ES in porcine lymphoid tissue samples by DAS-ELISA

3 討 論

葡萄球菌腸毒素對食品安全和人類健康有嚴重影響，基因水平的研究表明多種新型SEs 的存在[7]，建立應用于食品及臨床樣品中SEs的特異、敏感、快速、分型檢測方法具有重要意義。由于不同SEs血清型間氨基酸序列高度同源性等因素[8]，難以獲得型特異性抗體用于檢測，使得定性、定量以及分型檢測成為研究難點[9]。

本研究所建立DAS-ELISA具有以下特點：檢測體系選擇了可識別SEA、SEO、SEQ、SEU、SEK、SEG等多種腸毒素的群特異性單克隆抗體分別作為包被與檢測抗體，可用于多種SEs的檢出；所選單抗特異性強、親和力高、可夾心配對，避免了選擇多抗中多組分復雜性引起的交叉反應、內源性過氧化物干擾、本底值偏高等問題，能滿足復雜食品原料中腸毒素檢測的要求；可實現(xiàn)SEA及多種新型腸毒素的定量檢測，特異性、重復性、穩(wěn)定性好，在0.312～10μg/mL范圍內有良好的線性相關，該方法檢測下限僅為0.307μg/mL，低于基于高效價多抗基礎上的檢測限為1ng/mL的ELISA方法[10-11]。且單抗強的特異性、低交叉反應、易于標準化等優(yōu)點，更適合于檢測試劑盒的研制，通過生物素(B)-親和素(A)等生物放大系統(tǒng)可進一步提高檢測靈敏度。

所建DAS-ELISA方法，可檢測模擬食品環(huán)境的培養(yǎng)基質中天然SEs產(chǎn)生的變化情況，分析其分泌規(guī)律。對天津地區(qū)部分養(yǎng)殖條件較差的個體養(yǎng)殖場鮮牛乳樣品及豬肉淋巴結組織中的SEs檢測表明，奶、肉中存在較高的SEs檢出率(陽性檢出率分別為51.7%和59.1%)，且相當數(shù)量陽性樣品接近或超過中毒劑量。葡萄球菌是動物性食品原料保藏及加工等過程中極易污染的細菌，其產(chǎn)生的SEs具有超抗原活性容易導致機體的免疫紊亂，加之其耐高溫高壓等特性，使其安全風險倍增[12]。隨著我國膳食結構的變化，動物性食品原料所占比例的提高，SEs中毒給食品安全帶來新挑戰(zhàn)。但目前國內除部分進口嬰幼兒乳粉進行產(chǎn)SEs檢測外，其他乳制品、肉制品加工及出售前僅進行葡萄球菌的檢測。制訂奶、肉等動物性食品中SEs的相關檢測標準尚不完善，加強其控制及監(jiān)管，將對防止食源性中毒的發(fā)生具有重要意義。

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Development and Application of DAS-ELISA for Detection of Staphylococcal Enterotoxin

LIU Peng-chong1，HUANG Jin-hai1,*，LIU Li1，LIU Ying1，LIU Zhuang2，SUN Ying1
(1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China；

2. Dairy Food Monitoring Center of Tianjin City, Tianjin 300381, China)

Staphylococcal enterotoxin (SE) is an important pathogenic factor for human food-borne diseases. Based on a couple of monoclonal antibodies with high sensitivity and affinity, a rapid, sensitive, specific DAS-ELISA method for the quantitative detection of SE was established. The linear regression equation was y＝4.074x－1.1888 (R2＝0.9892). The detection limit was 0.307 μg/mL. The average recovery rates for SE in skim milk powder were 103%－107% with relative standard deviation (RSD) of less than 10%. In addition, the method was also successfully used for monitoring the dynamic change of SE secretion in culture supernatants of Staphylococcus aureus isolates, indicating that it can be used not only for the detection of enterotoxin-producing strains but also for monitoring the secretion of SE. Moreover, the positive rates of the method for the detection of SE in fresh milk and porcine lymphoid samples were 51.7% and 59.1%, respectively. The total coincidence rate between the results obtained by the method and imported kit was 92.5%. Therefore, the method was sensitive and efficient and could provide an effective technical support for monitoring food-borne pollution.

Staphylococcus aureus；staphylococcal enterotoxin；double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(DAS-ELISA)；detection method

R378.11

A

1002-6630(2012)08-0195-04

2011-04-02

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目(08JCZDJC22600)

劉鵬翀(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：lpc_liupengchong@126.com

*通信作者：黃金海(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為微生物工程。E-mail：jinhaih@163.com