熊建飛，周光明*，許 麗，張 磊

(發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

離子色譜法測(cè)定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖

熊建飛，周光明*，許 麗，張 磊

(發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定奶粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法。以METROSEP CARB 1(150mm×4.0mm)陰離子交換柱為分離柱，脈沖安培檢測(cè)，37mmol/L NaOH溶液為淋洗液，以檸檬酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑。葡萄糖、蔗糖和乳糖的線性范圍分別為1～40、1～50、1～50mg/L，相關(guān)系數(shù)分別0.9966、0.9968、0.9985，檢出限分別為0.014、0.091、0.083mg/L，精密度為1.10%～4.96%，回收率為90.13%～104.83%。該方法分析時(shí)間短，前處理簡(jiǎn)單，適用于快速測(cè)定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖。

高效陰離子交換色譜；脈沖安培檢測(cè)；奶粉；葡萄糖；蔗糖；乳糖；檸檬酸

奶粉中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)、維生素、礦物質(zhì)等，其中糖類(lèi)是一種比較重要的物質(zhì)。如乳糖是奶粉中含量較高的一種糖，經(jīng)乳糖酶作用后形成有機(jī)酸，可以促進(jìn)鈣離子的吸收，另外乳糖還能夠促進(jìn)有益菌的成長(zhǎng)，有利于腸道健康。但是有些人體內(nèi)缺乏乳糖酶，使乳糖消化和吸收受到阻礙，即所謂的乳糖不耐受[1]。乳糖不耐受者食用過(guò)量乳糖后會(huì)出現(xiàn)腹瀉、腹痛等癥狀。蔗糖是常用的食品添加劑之一，常被加入奶粉中以提高含糖量。食用過(guò)量蔗糖會(huì)危害身體健康，如蛀牙、肥胖等。因此測(cè)定奶粉中的糖對(duì)于控制奶粉質(zhì)量和指導(dǎo)消費(fèi)者具有重要意義。

目前，測(cè)定糖的方法主要有高效液相色譜法[2-3]、氣相色譜法[4]、毛細(xì)管電泳色譜法[5]等，這些方法大多存在衍生化處理或靈敏度低等缺陷。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測(cè)定糖的有效方法，靈敏度高，樣品前處理簡(jiǎn)單，可直接分離測(cè)定單糖、二糖和小分子寡糖[6]。糖類(lèi)化合物具有弱酸性，在堿性環(huán)境中能夠解離成陰離子，可根據(jù)其解離常數(shù)的不同進(jìn)行分離。在強(qiáng)堿性(pH＞12)環(huán)境中糖類(lèi)化合物可在電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，從而引起電流變化，因此可用脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[7]。該法通常以NaOH溶液為流動(dòng)相，為糖的解離和檢測(cè)提供了一個(gè)堿性環(huán)境。離子色譜法測(cè)定糖已有較多報(bào)道，如測(cè)定蜂蜜和葡萄酒中的糖[8]、測(cè)定蜂蜜和蜂膠中的糖[9]、測(cè)定茶葉中的糖[10]等，但是用離子色譜法同時(shí)測(cè)定奶粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖還未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。

奶粉中含有較多的蛋白質(zhì)，目前蛋白質(zhì)的沉淀劑多為乙酸、乙酸鋅、三氯乙酸、草酸鈉-磷酸氫二鈉混合液等[11-15]。乙酸具有揮發(fā)性，乙酸鋅在堿性環(huán)境中生成沉淀，三氯乙酸具有毒性，草酸鈉-磷酸氫二鈉配制較為繁瑣。而本實(shí)驗(yàn)擬采用檸檬酸作為沉淀劑，沉淀快速完全，操作簡(jiǎn)單，并且檸檬酸不具有揮發(fā)性和毒性，優(yōu)化處理?xiàng)l件，擬建立高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定奶粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

學(xué)生奶粉(碳水化合物≤56%)、老年奶粉(碳水化合物≤55%)、全脂甜奶粉(加蔗糖17g/100g)、全脂奶粉(低糖) 市售。

葡萄糖(分析純)、蔗糖(生化試劑)、琥珀酸(分析純)成都市科龍化工有限公司； 乳糖(分析純) 寧波大川精細(xì)化工有限公司；檸檬酸(分析純) 成都化學(xué)試劑廠；NaOH(分析純) 重慶川東化工有限公司。實(shí)驗(yàn)用水：去離子水(電阻率≥18.2MΩ·cm)。

861型離子色譜儀、METROSEP CARB 1(150mm×4.0mm)陰離子交換柱、817脈沖安培檢測(cè)器、IC-Net 2.3色譜工作站 瑞士萬(wàn)通公司；FA2004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；GM-0.33II隔膜真空泵 天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠；CQ50超聲波清洗器 上海必能信超聲波有限公司；布氏漏斗、0.45μm微孔濾膜。

1.2 色譜條件

分離柱：METROSEP CARB 1(150mm×4.0mm)陰離子交換柱；檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器；淋洗液：37mmol/L NaOH溶液；柱溫：32℃；流速：1.0mL/min；再生液：200mmol/L NaOH溶液；峰面積定量。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和淋洗液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別精密稱(chēng)取葡萄糖、蔗糖、乳糖、檸檬酸、琥珀酸0.1000g，放入100mL容量瓶中，加入20mL去離子水，攪拌溶解置入100mL容量瓶中定容至刻度，配成1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

淋洗液的配制：稱(chēng)取8.00g NaOH固體于100mL容量瓶中溶解轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中定容，配成200mmol/L的NaOH溶液作為再生液。同樣的方法分別稱(chēng)取1.00、1.20、1.40、1.48、1.60、1.80、2.00g NaOH 固體配制成25、30、35、37、40、45、50mmol/L的NaOH溶液作為淋洗液。

1.4 沉淀劑的選擇與樣品前處理

沉淀劑的選擇：分別選用檸檬酸和琥珀酸來(lái)沉淀奶粉中的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在加入相同量的檸檬酸和琥珀酸時(shí)，蛋白質(zhì)都能夠沉淀，但是檸檬酸使蛋白質(zhì)沉淀速度快而且沉淀顆粒大，而用琥珀酸作沉淀劑時(shí)，沉淀顆粒較小且沉淀速度稍慢。放置10min后，以檸檬酸作為沉淀劑的奶粉上清液比琥珀酸清澈。故本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

樣品前處理：精密稱(chēng)取0.1000g奶粉，放入50mL小燒杯中，加入10mL去離子水，攪拌均勻后超聲15min，加入6mL 1000mg/L檸檬酸，緩慢攪拌，放置2h，用布氏漏斗過(guò)濾，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，在濾液中加入NaOH溶液使pH10，再用0.45μm微膜濾紙過(guò)濾，定容至100mL，取濾液8mL于100mL容量瓶中定容，進(jìn)樣。

加入NaOH溶液的目的是使樣品中的Ca2+、Mg2+、Fe3+等轉(zhuǎn)化為沉淀以免樣品進(jìn)入色譜柱后在堿性環(huán)境中生成沉淀而損害色譜柱。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 淋洗液濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察NaOH溶液濃度對(duì)分離度的影響，從圖1可以看到，隨著淋洗液濃度的增大，葡萄糖和乳糖的保留時(shí)間逐漸縮短，蔗糖的保留時(shí)間總體上也趨于縮短。當(dāng)NaOH溶液的濃度低于30mmoL/L時(shí)，葡萄糖和蔗糖峰有部分重疊，隨著淋洗液濃度的增大，二者的分離度逐漸變好，大于45mmoL/L時(shí)蔗糖與乳糖分離度變差。因此本實(shí)驗(yàn)選擇37mmoL/L NaOH溶液為淋洗液。標(biāo)準(zhǔn)圖譜如2圖所示。

圖1 淋洗液濃度對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of eluent concentration on retention time

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of a mixture of glucose, sucrose and lactose standards

2.1.2 柱溫的選擇

分別設(shè)定柱溫為20、25、32、35、40℃，結(jié)果表明，降低溫度，峰的分離度稍有改變，峰底變寬，而且柱壓逐漸增大，隨著溫度的升高分離度變差，綜合考慮選擇柱溫為32℃。

2.1.3 流速的選擇

分別設(shè)定流速為0.5、0.8、1.0、1.2、1.6mL/min，結(jié)果表明改變流速對(duì)分離度的影響很小，隨著流速的增大保留時(shí)間縮短，但柱壓升高，為了保護(hù)色譜柱和縮短分離時(shí)間，選擇1.0mL/min為流速。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和儀器檢出限

分別從1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.2、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0mL葡萄糖、蔗糖、乳糖于100mL容量瓶中定容配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)RSN＝3計(jì)算儀器檢出限，結(jié)果如表1所示，葡萄糖、蔗糖和乳糖的線性范圍分別為1～40、1～50、1～50mg/L，相關(guān)系數(shù)分別0.9966、0.9968、0.9985，檢出限分別為0.014、0.091、0.083mg/L；標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖2所示。由表1可知，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線沒(méi)有過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)，說(shuō)明存在基質(zhì)效應(yīng)，即在所測(cè)定的溶液中其他物質(zhì)對(duì)被分析物產(chǎn)生的影響和干擾。由2.3節(jié)回收率測(cè)定結(jié)果可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品中物質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定影響不大。

表1 線性范圍與檢出限Table 1 Linear regression equations, linear ranges and detection limits

2.3 精密度和加標(biāo)回收率

2.3.1 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

按照1.2節(jié)色譜條件和1.4節(jié)樣品處理方法，對(duì)樣品進(jìn)行5次測(cè)定做精密度實(shí)驗(yàn)，按峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，測(cè)定結(jié)果如表2所示，精密度在1.10%～4.96%之間。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of precision tests

2.3.2 回收率

測(cè)出本底值后，分別稱(chēng)取與測(cè)本底值時(shí)質(zhì)量相同的奶粉樣品(精確到0.001g)：學(xué)生奶粉0.1031g、老年奶粉0.1016g、全脂甜奶粉0.1012g、全脂奶粉0.1010g，在其中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用1.4節(jié)樣品處理方法進(jìn)行樣品前處理，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率如表3所示，回收率在90.13%～104.83%之間。

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Results of spike recovery tests

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

圖3 學(xué)生奶粉(A)和老年奶粉(B)樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of commercial milk powders

樣品色譜圖如圖3、4所示，測(cè)定結(jié)果如表4所示。由表4可知，學(xué)生奶粉、老年奶粉、全脂甜奶粉都含有葡萄糖、蔗糖和乳糖，其中葡萄糖含量較低，乳糖含量最高，而全脂奶粉只檢測(cè)到乳糖。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果Table 4 The results of the samples

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)表明，奶粉中主要含有3種糖：葡萄糖、蔗糖和乳糖。其中乳糖含量最高；葡萄糖含量最低；蔗糖在不同的奶粉中含量差別很大。不同的消費(fèi)者應(yīng)根據(jù)含糖量的不同來(lái)選擇適宜的奶粉。學(xué)生奶粉、老年奶粉和全脂奶粉測(cè)定結(jié)果與說(shuō)明書(shū)上糖(碳水化合物包括糖類(lèi)、淀粉、纖維素等)的含量基本相符，而全脂甜奶粉中蔗糖含量檢測(cè)值為22.27%，高于說(shuō)明書(shū)上的蔗糖添加量(17%)。本實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，適用于快速測(cè)定奶粉中的糖類(lèi)，為控制奶粉質(zhì)量提供了一種簡(jiǎn)便而有效的方法。

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Determination of Glucose, Sucrose and Lactose in Milk Powder by Ion Chromatography

XIONG Jian-fei，ZHOU Guang-ming*，XU Li，ZHANG Lei
(Key Laboratory on Luminescence and Real-time Analysis (Southwest University), Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A high performance anion exchange chromatographic-pulse amperometric detection method was established to determine glucose, sucrose and lactose in milk powder. The separation column used was METROSEP CARB 1 (150 mm ×4.0 mm) anion exchange column, and the mobile phase was 37 mmol/L NaOH. Citric acid was used to precipitate proteins from milk. The linear ranges of glucose, sucrose and lactose were 1－40, 1－50 mg/L and 1－50 mg/L with correlation coefficients of 0.9966, 0.9968 and 0.9985, respectively, and the detection limits were 0.014, 0.091 mg/L and 0.083 mg/L. The precision relative standard deviations of precision for 5 replicate determinations were in the range of 1.10%－4.96%. The recovery rates for glucose, sucrose and lactose in 4 different commercial samples were 90.13%－104.83%. The method was suitable for rapid determination of glucose, sucrose and lactose in milk powder, thanks to its short analysis time and simple pretreatment.

high performance anion exchange chromatography；pulsed amperometric detection；milk powder；sugar；citric acid

O657.75

A

1002-6630(2012)08-0176-04

2011-04-17

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(CSTC，2007BB5370)；國(guó)家科技部重大專(zhuān)項(xiàng)(2008ZX07315)

熊建飛(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)殡x子色譜。E-mail：feifei8487@163.com

*通信作者：周光明(1964—)，男，教授，博士后，研究方向?yàn)樯V與聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn