周麗卿，杜雙奎*，趙 佳，楊紅丹

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆蛋白提取工藝

周麗卿，杜雙奎*，趙 佳，楊紅丹

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以脫脂鷹嘴豆粉為材料，采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)鷹嘴豆蛋白的提取工藝條件進(jìn)行分析與優(yōu)化。結(jié)果表明，堿溶酸沉工藝參數(shù)對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率有顯著影響，因素影響主次順序?yàn)閜H值＞液料比＞提取時(shí)間。鷹嘴豆蛋白堿溶酸沉提取優(yōu)化工藝參數(shù)：pH11.0、液料比17.7:1(mL/g)、提取時(shí)間88.4min、提取溫度20℃，蛋白提取率達(dá)到82.33%。所得鷹嘴豆蛋白提取回歸模型高度顯著(R2＝0.9630)，擬合性好，可用于預(yù)測(cè)蛋白提取率。

鷹嘴豆蛋白；工藝參數(shù)；響應(yīng)面優(yōu)化

鷹嘴豆(Cicer arietinum L)，屬野豌豆族[1]，為一年生或多年生草本植物，是豆科植物中的稀有品種，因其種子外形獨(dú)特，類似鷹嘴而被稱為鷹嘴豆。鷹嘴豆耐干早、耐貧瘠，主要分布在溫暖而又比較干早的地區(qū)，如印度、巴基斯坦、墨西哥等。20世紀(jì)80年代在我國(guó)新疆、甘肅、青海、云南等地試種，是世界第二大消費(fèi)豆類，產(chǎn)量居世界豆類第二[2-3]。近幾年，我國(guó)鷹嘴豆產(chǎn)量成倍增長(zhǎng)，具有“鷹嘴豆之鄉(xiāng)”之稱的新疆木壘縣目前已經(jīng)形成了10萬畝的鷹嘴豆種植面積，占我國(guó)鷹嘴豆種植面積的83%。植物蛋白是人類所需蛋白質(zhì)的重要來源之一，是解決當(dāng)前世界人口日益膨脹問題的一種新的食物蛋白來源[4]。鷹嘴豆蛋白含量因種的不同而有較大差異，在15%～30%之間。鷹嘴豆蛋白是一種低過敏性、高生物效價(jià)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)功效比值、氨基酸含量和消化率等均優(yōu)于其他豆類，如木豆、綠豆[5-6]，被譽(yù)為“黃金豆”、“珍珠果仁”。我國(guó)平均每人每天攝入的蛋白質(zhì)含量約為80g，相比發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)蛋白質(zhì)的攝入量還處在較低水平[7]。鷹嘴豆蛋白作為一種新型植物蛋白資源，開發(fā)利用鷹嘴豆蛋白對(duì)緩解我國(guó)蛋白質(zhì)資源緊張有重要意義。

目前，有關(guān)鷹嘴豆的研究主要集中在對(duì)其藥理作用的探討[1,8-9]，而對(duì)鷹嘴豆蛋白資源綜合利用報(bào)道較少。本研究以鷹嘴豆為原料，采用堿溶酸沉法提取蛋白質(zhì)，研究提取工藝，優(yōu)化工藝參數(shù)，旨在為鷹嘴豆蛋白的提取及綜合開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆 新疆大龍王食品有限責(zé)任公司；G-250考馬斯亮藍(lán) 科邦生物公司；石油醚(30～60℃) 天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV mini-1240型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；KJELTEC2100型半自動(dòng)凱式定氮儀 瑞典富斯-特卡托公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HJ-3型數(shù)碼恒溫磁力攪拌器 福州精科儀器儀表有限公司；KDC-40型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

豆粉制備：用水浸泡鷹嘴豆過夜，撈去雜物，瀝去水分，采用手工去皮，40℃烘干后，高速粉碎機(jī)粉碎，過8 0目篩，裝自封袋4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

豆粉脫脂：取4L石油醚加入到2kg豆粉中，室溫下連續(xù)攪拌60min，豆粉自然沉降與上層有機(jī)溶劑分離，傾出有機(jī)溶劑進(jìn)行回收，沉淀豆粉再加石油醚重復(fù)上述操作2次。隨后將鷹嘴豆粉置于通風(fēng)櫥中室溫干燥12h，將處理好的脫脂豆粉裝自封袋中4℃保存、備用。

1.3.2 鷹嘴豆蛋白的提取

采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白[10]。

工藝步驟：脫脂鷹嘴豆粉→堿溶、浸提→離心→等電點(diǎn)沉淀→洗滌→低溫干燥→鷹嘴豆蛋白。

1.3.3 鷹嘴豆蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定[10]。

1.3.4 鷹嘴豆總蛋白含量測(cè)定

按GB/T 5511－2008《谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算：凱氏法》方法進(jìn)行[11]。

1.3.5 鷹嘴豆提取的蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[12]?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝0.0066C－0.0002，R2＝0.9987(其A為吸光度，C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(μg/mL))，表明在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與吸光度呈線性關(guān)系。

樣品蛋白含量測(cè)定：用2mol/L NaOH溶液將堿溶酸沉法提取得到的蛋白質(zhì)溶解，定容至25mL。吸取10μL蛋白液，測(cè)定其蛋白含量，再換算成25mL蛋白液中的蛋白含量即為提取的蛋白含量。

1.3.6 鷹嘴豆蛋白提取單因素試驗(yàn)

以提取鷹嘴豆蛋白的pH值、液料比、時(shí)間、溫度為試驗(yàn)因素，以鷹嘴豆蛋白提取率作為試驗(yàn)指標(biāo)，分別做單因素試驗(yàn)，以分析各因素對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率的影響。

1.3.7 鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取pH值、提取液料比、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以蛋白提取率為響應(yīng)指標(biāo)，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆蛋白等電點(diǎn)的確定

圖1 吸光度隨pH值變化曲線Fig.1 Absorbance of extract supernatant of chickpea with pH

由圖1可以看出，隨著pH值變化，上清液的吸光度先減小后增大。當(dāng)pH4.3時(shí)，上清液的吸光度最小，表明上清液中殘留的蛋白質(zhì)含量最少，此時(shí)，體系pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)凈的正、負(fù)電荷數(shù)總和為零，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間靜電排斥作用降低而聚合沉淀。表明鷹嘴豆蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI＝4.30，這與Boye等[13]報(bào)道的鷹嘴豆蛋白的pI值一致。

2.2 鷹嘴豆蛋白提取工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH值的選擇

圖2 pH值對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction rate of chickpea protein

在提取溫度20℃、液料比10:1、提取時(shí)間60min條件，pH值對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率的影響結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，pH值對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率有顯著影響。隨著浸提溶液pH值升高，提取率呈上升趨勢(shì)，堿性條件下的提取率顯著高于酸性條件下，pH10～12提取率差異不顯著，這與一般植物蛋白在不同pH值下的溶解規(guī)律一致，但pH值過高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不利的化學(xué)反應(yīng)，如影響產(chǎn)品色澤，形成有毒的縮和氨基酸，從而降低蛋白質(zhì)食用價(jià)值[14]。綜合考慮，選擇pH值范圍為9～11。

2.2.2 液料比的確定

在提取溫度20℃、pH8.0、提取時(shí)間60min條件下，液料比對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of chickpea protein

從圖3可知，當(dāng)液料比在5:1～20:1變化時(shí)，隨著提取溶劑比例的增加，提取率增大。但當(dāng)液料比繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)提取率下降。因?yàn)檫m當(dāng)增大液料比，有利于蛋白質(zhì)的充分溶出，而使提取率增大[15-16]。但液料比過大，使得蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用增加，使得蛋白質(zhì)分子不容易沉淀，在酸沉?xí)r會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)流失到上清液，反而造成蛋白質(zhì)損失[17]。因此，合適液料比為20:1。

2.2.3 提取時(shí)間的選擇

在提取溫度20℃、pH8.0、液料比10:1條件下，提取時(shí)間對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of chickpea protein

由圖4可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為80min，鷹嘴豆蛋白的提取率達(dá)到最大。分析原因可能是由于一定時(shí)間后，蛋白的溶出達(dá)到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進(jìn)一步延長(zhǎng)浸提時(shí)間，可能因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的攪拌使蛋白質(zhì)變性，從而使提取率降低[17]。還有可能是鷹嘴豆淀粉與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)難以溶出[10]，因此提取時(shí)間選擇80min。

2.2.4 提取溫度的選擇

在pH8.0、液料比10:1、提取時(shí)間60min條件下，提取溫度對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of chickpea protein

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，但變化幅度不明顯。在30℃時(shí)出現(xiàn)低谷，可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致部分易變性蛋白質(zhì)變性，其蛋白質(zhì)提取率降低與部分熱變性溫度較高的蛋白質(zhì)提取率增加共同作用的結(jié)果。不同提取溫度下鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率沒有顯著差異。因此，從節(jié)約能源及簡(jiǎn)化提取工藝考慮，提取溫度采用20℃。

2.3 鷹嘴豆蛋白提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 回歸模型的建立

響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的因素水平編碼見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。每個(gè)試驗(yàn)組合重復(fù)試驗(yàn)2次，取其平均值作為提取率結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 7.0.0軟件分析。

表1 鷹嘴豆蛋白提取工藝Box - Behnken設(shè)計(jì)因素及水平編碼Table 1 Variables and their coded levels for Box-Behnken design

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得鷹嘴豆蛋白質(zhì)得率對(duì)pH(X1)、液料比(X2)和提取時(shí)間(X3)的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

表4 回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of each regression coefficient

由回歸模型方差分析結(jié)果可以看出(表3)，模型P＝0.0003＜0.01，高度顯著，失擬項(xiàng)P＝0.2802＞0.05不顯著，表明所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)堿溶酸沉提取工藝參數(shù)。由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，X1、X2、X1X2對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率的影響高度顯著，X3、X1X3、X12對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率的影響顯著，X2X3、X32、X22對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著。影響蛋白質(zhì)提取率的主次因素依次為A＞B＞C，即pH值＞液料比＞提取時(shí)間。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析

圖6 兩因素及其交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of chickpea protein

由圖6a可知，提取時(shí)間為60min時(shí)，隨著pH值的升高，在低液料比下，蛋白質(zhì)提取率呈增大趨勢(shì)，但在高液料比下，蛋白質(zhì)提取率卻呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，這與液料比與pH值之間負(fù)交互作用高度顯著有關(guān)。由圖6b可以看出，液料比為20:1，在提取時(shí)間為較低水平時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著pH值升高呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取液的pH增大時(shí)，蛋白提取率達(dá)最大。

對(duì)回歸模型分析，得鷹嘴豆蛋白堿溶優(yōu)化工藝參數(shù)為pH11.0、液料比17.7:1和時(shí)間88.4min，鷹嘴豆蛋白理論提取率可達(dá)83..47%。對(duì)優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得鷹嘴豆蛋白提取率為82.33%，與理論值偏差1.38%，沒有顯著差異。

3 結(jié) 論

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立了堿溶酸沉法鷹嘴豆蛋白提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)鷹嘴豆蛋白的提取率。堿溶酸沉法工藝參數(shù)對(duì)鷹嘴豆蛋白提取率有顯著影響，因素影響主次順序?yàn)閜H值＞液料比＞提取時(shí)間。鷹嘴豆蛋白提取優(yōu)化工藝參數(shù)為pH11.0、液料比17.7:1、時(shí)間88.4min、提取溫度20℃，鷹嘴豆蛋白提取率可達(dá)82.33%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得優(yōu)化工藝參數(shù)，可為工業(yè)化蛋白提取提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

[1] 楊建梅, 張慧, 余琛, 等. 鷹嘴豆的研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 12(1): 89-90.

[2] 張濤, 江波, 王璋. 鷹嘴豆分離蛋白質(zhì)的特性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2010, 38(10): 145-158.

[3] POLTRONIERI F, AREAS J A G, COLLI C. Extrusion and iron bioavailability in chiekpea (Cicer arietinum L.)[J]. Food Chem, 2000,70(2): 175-178.

[4] 饒國(guó)華, 趙謀明, 林偉鋒, 等. 低次煙葉蛋白質(zhì)提取工藝研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 33(11): 67-72.

[5] ZER S, KARAKY T, TOKLU F, et al. Nutritional and physicochemical variation in Turkish kabuli chickpea (Cicer arietinum L.) landraces[J]. Euphytica, 2010, 175(2): 237-249.

[6] ERCAN R, KKSEL H, ATLI A, et al. Cooking quality andcomposition of chickpea grown in Turkey[J]. Gida, 1995, 20(5): 289-293.

[7] CHIESA S, GNANSOUNOU E. Protein extraction from biomass in a bioethanol refinery-possible dietary applications: use as animal feed and potential extension to human consumption[J]. Bioresource Technology,2011, 102(2): 427-436.

[8] 全智慧, 徐暾海. 鷹嘴豆的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2009, 20(12):3111-3112.

[9] 包興國(guó), 楊蕊菊, 舒秋萍. 鷹嘴豆的綜合開發(fā)與利用[J]. 草業(yè)科學(xué),2006, 23(10): 34-37.

[10] 朱振寶, 易建華. 堿溶酸沉法提取甜蕎麥蛋白及其氨基酸分析[J]. 食品科技, 2009, 34(8): 193-197.

[11] 全國(guó)糧油標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). GB/T 5511—2008 谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[12] 李鳳英, 崔蕊靜, 李春華. 葡萄籽蛋白質(zhì)的提取工藝研究[J]. 中國(guó)油脂, 2005, 30(4): 36-39.

[13] BOYE J I, AKSAY, S, ROUFIK, S, et al. Comparison of the functional properties of pea, chickpea and lentil protein concentrates processed using ultra ltration and isoelectric precipitation techniques[J]. Food Research International, 2010, 43(2): 537-546.

[14] 管斌, 林洪, 王廣策. 食品蛋白質(zhì)化學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2005: 335-336.

[15] 鄧紅, 田蕓蕓, 田子卿. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(8): 197-323.

[16] SUN Xiaohong, ZHU Kexue, ZHOU Huiming. Optimization of a novel backward extraction of defatted wheat germ protein from reverse micelles[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009(10):328-333.

[17] 矯麗媛, 呂敬軍, 陸豐升. 花生分離蛋白提取工藝優(yōu)化研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(10): 196-201.

Optimization of Chickpea Protein Extraction Using Response Surface Methodology

ZHOU Li-qing，DU Shuang-kui*，ZHAO Jia，YANG Hong-dan
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The purpose of the present study was to optimize alkali protein extraction from defatted chickpea using one-factorat-a-a-time method and response surface methodology. The results showed that all investigated parameters had a notable effect on the extraction yield of chicken protein and could be ranked in decreasing order of importance in their effects as follows: pH ＞liquid-to-material ratio＞extraction time. The optimal extraction parameters were pH 11.0 and 17.7:1 (mL/g) of liquid-to-material ratio for 88.4 min of extraction at 20 ℃, resulting in an extraction yield of 82.33%. The established regression model describing the extraction yield of chicken protein as a function of three extraction parameters was highly significant (R2＝0.9630). The predictive and experimental results were found to be in good agreement. Thus, the model was applicable for the prediction of protein yield.

chickpea protein；process parameters；response surface optimization

TS214.9

A

1002-6630(2012)08-0066-05

2011-04-09

陜西省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2008K01-02)

周麗卿(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)殡s豆開發(fā)與利用。E-mail：zhouliqingisagirl@yahoo.com.cn

*通信作者：杜雙奎(1972—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)殡s糧資源開發(fā)與利用。E-mail：dushuangkui@nwsuaf.edu.cn