芮廣虎，胡雪芹*，殷 坤，張洪斌

(合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

響應(yīng)面法優(yōu)化短短芽孢桿菌F M4 B的發(fā)酵培養(yǎng)基

芮廣虎，胡雪芹*，殷 坤，張洪斌

(合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

采用Plackett-Burman法考察發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分對抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：葡萄糖、蔗糖、K2HPO4的質(zhì)量濃度對抗真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量影響顯著。再采用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法對3個主要因素進行分析，得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO4 0.825、MgSO4·7H2O 0.5。采用該法優(yōu)化所得的培養(yǎng)基，其抑菌圈面積增加了42%。

短短芽孢桿菌；生物防治；Box-Behnken試驗；響應(yīng)曲面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

近年來，食品安全得到了人們的普遍關(guān)注。由食品安全引發(fā)的問題，已成為人類健康的主要影響因素，各國政府紛紛將保證和提高食品安全視為提高人民生活質(zhì)量、保持社會穩(wěn)定和經(jīng)濟發(fā)展的重大戰(zhàn)略問題[1]。然而，人均耕地面積日漸減少，要求提高單位面積作物產(chǎn)量，最大程度地減少病蟲害，導(dǎo)致大量使用化學(xué)農(nóng)藥對農(nóng)作物進行保護。化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用，污染和破壞了生態(tài)環(huán)境，帶來了嚴重的后果，食品中殘留農(nóng)藥的毒害事故頻頻發(fā)生。因此，控制與消除化學(xué)農(nóng)藥污染，開發(fā)與環(huán)境和諧的生物防治方法，已成為環(huán)境保護的一個熱點問題。

農(nóng)作物的枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的土傳真菌性病害，難防難治。國內(nèi)外已有大量生物防治農(nóng)作物病蟲害的相關(guān)報道。據(jù)報道[2-5]，芽孢桿菌(Bacillusspp.)是一類在自然界中廣泛存在的微生物，可產(chǎn)生抗生素、細菌素、抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)。這類細菌多為革蘭氏陽性菌，可以形成芽孢，細胞壁不含內(nèi)毒素，對人畜無害[6]，是非常有價值的生防菌。

本實驗室從西瓜植株根際周圍篩選到一株拮抗菌FM4B，經(jīng)鑒定為短短芽孢桿菌，離體條件下，其發(fā)酵液對多種枯萎病病菌的生長有很強的抑制作用，前期實驗表明該菌及發(fā)酵液能降低西瓜枯萎病發(fā)病率，并能促進西瓜植株的生長[7]。因此，具有很好的研究價值及開發(fā)前景。為了提高抗枯萎病菌活性物質(zhì)產(chǎn)量，本實驗采用響應(yīng)面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，可以快速地從眾多的試驗因素中挑選出影響顯著的因素，對顯著因素做進一步的優(yōu)化，得出最優(yōu)的培養(yǎng)基組成。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試生防菌為短短芽孢桿菌Brevibacillus brevisFM4B菌株，由本實驗室提供；活性指示菌為西瓜枯萎病菌Fusariurn oxysporumf.sp.niveum，由上海交通大學(xué)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SL202N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠；KQ-500型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HQ45B型恒溫搖床 中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

PDA培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、土豆200、瓊脂18，pH值自然。斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂18，pH7.0，28℃培養(yǎng)24h。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨23.1、K2HPO40.1、MgSO4·7H2O 0.5，pH7.5。

培養(yǎng)條件：從斜面上挑取3環(huán)接種到含50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶里，30℃、200r/min培養(yǎng)15h，得種子液。按5%的接種量接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28℃、180r/min培養(yǎng)21h，離心除菌體，得活性物質(zhì)發(fā)酵液。

1.4 抗真菌活性的測定方法

抗真菌活性的測定采用杯碟法，以沒有指示菌生長的區(qū)域面積來表示抗菌活力。300μL指示菌孢子懸液(105CFU/mL)與50℃的20mL PDA培養(yǎng)基混合搖勻后倒平板。在凝固的平板上打孔(直徑6mm)，每孔中加入活性物質(zhì)發(fā)酵液100μL，28℃培養(yǎng)48h，觀察并計算抑菌圈面積。

1.5 方法

1.5.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)預(yù)實驗研究的結(jié)果[8]， FM4B菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分主要有：葡萄糖、FeSO4·7H2O、蔗糖、黃豆餅粉、蛋白胨、NH4NO3、酵母膏、K2HPO4和MgSO4·7H2O。采用Plackett-Burman試驗設(shè)計[9-10]，見表1，擬合方程為：Y＝γ0＋γ1X1＋γ2X2＋γ3X3＋γ4X4＋γ5X5＋γ6X6＋γ7X7＋γ8X8＋γ9X9

表1 Plackett-Burman試驗分析因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.5.2 最陡爬坡試驗設(shè)計

對Plackett-Burman試驗的因素作顯著性分析，找出主要因素。根據(jù)擬合函數(shù)回歸系數(shù)的符號和大小來設(shè)計主要因素的最陡上升路徑，正效應(yīng)的因素均取較高值，負效應(yīng)的因素均取較低值。試驗組數(shù)由經(jīng)驗來定，步長由主要因素的效應(yīng)值確定。通過使主要因素同時朝響應(yīng)值增大的方向變化，找出峰值，從而逼近最大的響應(yīng)區(qū)域[11-12]。

1.5.3 Box-Behnken試驗設(shè)計[11]

根據(jù)1.5.1、1.5.2節(jié)的實驗結(jié)果，用SAS (Version8.1)進行響應(yīng)面試驗設(shè)計并對試驗數(shù)據(jù)進行回歸性分析，用t檢驗驗證回歸系數(shù)的顯著性，用F檢驗評價模型方程的顯著性，方程的擬合性由R2確定。

1.6 模型驗證

用SAS(Version8.1)對多元函數(shù)進行擬合和方差分析。對自變量求偏導(dǎo)數(shù)，可確定出其極值點[10]。再按照計算所得到的參數(shù)進行驗證實驗，以檢驗?zāi)Ｐ偷闹貜?fù)性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗對主要因素的篩選

采用Plackett-Burman法，對9個組分進行考察。每個組分取高水平(＋1)和低水平(－1)，見表2。各組分所代表的高低水平和方差分析結(jié)果，見表3。

表2 Placket-Burman設(shè)計與響應(yīng)值Table2 Placket-Burman design and corresponding results

表3 各因素影響的主效應(yīng)分析Table 3 Main effects analysis of medium components

由表3可知，培養(yǎng)基組分對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響顯著性[13]的排序為：葡萄糖＞蔗糖＞K2HPO4＞FeSO4·7 H2O＞黃豆餅粉＞酵母膏＞蛋白胨＞N H4N O3＞MgSO4·7H2O。顯然，葡萄糖、蔗糖和K2HPO4的影響較為突出，葡萄糖對于菌體產(chǎn)抑菌物質(zhì)呈現(xiàn)負效應(yīng)，蔗糖和K2HPO4呈正效應(yīng)。這些效應(yīng)關(guān)系用方程式表示為：Y＝337.1667－62.5X1＋53.83333X3＋40.83333X8，方程R2＝0.9618，表明該回歸方程擬合良好。從方程中還可以看出，要提高產(chǎn)量，應(yīng)適當降低葡萄糖質(zhì)量濃度，提高蔗糖和K2HPO4質(zhì)量濃度。

2.2 最陡爬坡試驗研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域

根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計法篩選出的主要組分的效應(yīng)大小設(shè)計它們的步長，進行最陡爬坡試驗設(shè)計，尋找最大產(chǎn)量區(qū)。試驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示。最大產(chǎn)量區(qū)在試驗號2附近。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Steepest ascent procedure and corresponding results

2.3 Box-Behnken試驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分

表5 響應(yīng)面分析試驗因素水平表Table 5 Factors and levels of response surface analysis

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，以試驗號2的條件為響應(yīng)面試驗因素水平的中心點。響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表5。采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計確定主要因素的最優(yōu)水平，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。SAS(Version8.1)擬合出的回歸方程模型為：Y＝395.3333－19.75x1＋7.75x2－11x3－13.16667x12－4.5x1x3＋12.16667x22＋8.5x2x3－9.166667x32?；貧w方程的方差分析見表7。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計和對應(yīng)結(jié)果Table 6 Box-Behnken design and corresponding response values

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for the proposed quadratic polynomial model

方程自變量平方項的符號皆為負值，則拋物線的開口向下，所以有對應(yīng)的極大值點[10]。由方差分析得出大于F值的概率為0.003877，表明回歸方程模型的顯著性及可靠性很好；而且方程R2＝0.9651，表明了響應(yīng)模型可以解釋96.51%的總體變異情況，只有3.49%的變異無法用模型來解釋[14-16]，回歸模型有高度的相關(guān)性[17]。這個模型可以用于活性物質(zhì)產(chǎn)量的分析和預(yù)測。聯(lián)合響應(yīng)面回歸分析和回歸方程繪制的響應(yīng)面圖形如圖1～3所示。

圖1 x1與x2交互作用對Y值預(yù)測響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x2

圖2 x2與x3交互作用對Y值預(yù)測響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y versus x2 and x3

圖3 x1與x3對Y值預(yù)測響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x3

通過觀察上述圖形的變化趨勢得出：x1、x2、x3在試驗范圍內(nèi)存在極大值點。這3個組分的最優(yōu)試驗點(x1,x2,x3)為(0.917, 0.500, 0.000)，即葡萄糖6.1g/L、蔗糖31.3g/L、K2HPO40.825g/L，在此點預(yù)測的抑菌圈面積為403mm2；x1x2交互作用的等高線近似圓形，則兩者的交互作用不顯著；x2x3和x1x3交互作用的等高線都是橢圓，則兩元素間的交互作用顯著[18]。

2.4 驗證實驗

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準確性，在優(yōu)化條件下進行3組裝液量為50mL/250mL的發(fā)酵實驗，所測的抑菌圈面積都在400mm2以上，平均值為405mm2。與模型預(yù)測值非常接近，表明設(shè)計模型能很好的預(yù)測實際的發(fā)酵情況。

3 結(jié) 論

SAS全稱為Satistics Aalysis System，它是包括數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析、運籌等為題的科學(xué)計算等大量模塊的集成軟件系統(tǒng)。Plackett-Burman試驗設(shè)計法的優(yōu)越之處在于試驗次數(shù)少，周期短，精度高[19]，從眾多的考察因素中挑選出影響試驗的幾個主要因素，以供進一步的深入研究[20]。響應(yīng)面法可以對影響生物產(chǎn)量的主要因素的含量和它們間的交互作用進行優(yōu)化和評價，確定出多因素體系的最優(yōu)解。

本研究通過采用Plackett-Burman試驗設(shè)計，對影響菌株FM4B代謝產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的9個組分進行了評價和分析，篩選出葡萄糖、蔗糖、K2HPO4為影響產(chǎn)量的主要因素。然后根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，確定了培養(yǎng)基的最優(yōu)組分為(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO40.825、MgSO4·7H2O 0.5。發(fā)酵液的抑菌圈面積由原來的285mm2提高到405mm2，增加了42%，進一步提高了FM4B菌株的抑菌活性。

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Medium Optimization for Antifungal Substance Production byBrevibacillus brevisFM4B Using Response Surface Methodology

RUI Guang-hu，HU Xue-qin*，YIN Kun，ZHANG Hong-bin
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of 9 medium components on the production of antifungal substance byBrevibacillus brevisFM4B. The results showed that glucose, peptone and K2HPO4 were the most important medium components. Steepest ascent procedure and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were employed to optimize the three medium components. The optimal fermentation medium for producing antifungal substance was composed of glucose 6.1 g/L, peptone 23.1 g/L, sucrose 31.3 g/L, K2HPO4 0.825 g/L and MgSO4·7H2O 0.5 g/L. The inhibition spot area of the optimized culture medium after fermentation withBrevibacillus brevisFM4B was increased by 42% compared to that of the original medium.

Brevibacillus brevis；biological control；central composite design；response surface methodology；medium optimization

S432.4

A

1002-6630(2012)15-0257-05

2011-06-16

合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目(2010052)

芮廣虎(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為生物制藥工程。E-mail：ruiguanghu2008@163.com

*通信作者：胡雪芹(1976—)，女，副教授，研究方向為微生物制藥。E-mail：huxueqin12345@163.com