穆昭艷，汪立平,*，張大兵，李安雪，汪 欣

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

異甘露聚糖酶生產(chǎn)菌的誘變育種及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

穆昭艷1，汪立平1,*，張大兵2，李安雪1，汪 欣1

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

為了提高異甘露聚糖酶活性，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株分泌異甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌K-6(Bacillus subtilisK-6)進(jìn)行紫外誘變育種，并優(yōu)化一株正突變株的固態(tài)發(fā)酵條件。出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌K-6的酶活力為206.0U/mL，經(jīng)紫外線誘變處理后，挑選在培養(yǎng)基上透明水解圈較大的菌株進(jìn)一步復(fù)篩，獲得枯草芽孢桿菌K-6-9高產(chǎn)突變株，酶活力為349.3U/mL，高于出發(fā)菌株69.6%。連續(xù)5代發(fā)酵，K-6-9的酶活力范圍為343.0～350.3U/mL，表明該突變菌株產(chǎn)酶性能穩(wěn)定。以K-6-9為菌種，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)進(jìn)行最佳固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，結(jié)果表明：該突變株的固態(tài)發(fā)酵適宜發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間72h、接種量3%、初始pH 7.5、裝料量25g/250mL；培養(yǎng)基組成為：酵母細(xì)胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麩皮添加量40%，此優(yōu)化條件下固態(tài)發(fā)酵K-6-9菌株產(chǎn)酶酶活力最高達(dá)601.6U/mL。

異甘露聚糖酶；誘變育種；固態(tài)發(fā)酵

甘露聚糖酶是一種內(nèi)切水解酶[1]，作用底物主要是甘露聚糖，其主要水解產(chǎn)物為單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖[2]。根據(jù)其作用底物不同，甘露聚糖酶可分為β-甘露聚糖酶和異甘露聚糖酶[3]，其中，β-甘露聚糖酶的作用底物為魔芋粉、槐豆膠等植物多糖，通過β-1,4-D-甘露吡喃糖苷鍵連接而成的直鏈或支鏈聚合糖；異甘露聚糖酶的作用底物為主要存在于酵母等微生物的細(xì)胞壁中的異甘露聚糖，異甘露聚糖以α-1,6-D-甘露糖為骨架鏈，其中大部分甚至全部的殘基具有α-1,2-或-1,3-連接的含有2～5個(gè)甘露糖殘基的側(cè)鏈。經(jīng)異甘露聚糖酶水解得到的甘露寡糖經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物的生長發(fā)育具有一系列積極作用。如促進(jìn)動(dòng)物生長、提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化效率[4-6]；促進(jìn)消化，改善動(dòng)物腸道微生物生態(tài)環(huán)境及健康狀況[7]；促進(jìn)動(dòng)物腸道有益菌的生長[8]；提高機(jī)體免疫活性和抑制腫瘤生長[9]；吸附真菌毒素，減少抗生素等化學(xué)藥物的使用是生產(chǎn)綠色動(dòng)物食品的添加劑[10]。

啤酒廢酵母是啤酒生產(chǎn)中最主要的副產(chǎn)物，我國大多數(shù)廠家主要處理啤酒廢酵母的方式是將其直接干燥后作為飼料，其經(jīng)濟(jì)效益甚微[11]。因此利用微生物技術(shù)將啤酒廢酵母中的甘露聚糖開發(fā)出附加值高、技術(shù)含量高、有足夠競(jìng)爭(zhēng)性的甘露寡糖新產(chǎn)品，可為廢棄的啤酒酵母再利用提供了新思路，并提高了經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本研究將以實(shí)驗(yàn)室保藏的分泌異甘露聚糖酶的一株枯草芽孢桿菌K-6為出發(fā)菌株，通過紫外誘變育種進(jìn)行菌種改良，并對(duì)誘變改良后的最優(yōu)菌株的產(chǎn)酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從而高效制備異甘露聚糖酶，為啤酒廢酵母中甘露聚糖的充分利用提供理論基礎(chǔ)和部分技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

產(chǎn)異甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌K-6(Bacillus subtilisK-6)菌株，由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)研究室篩選和保藏。

瓊脂粉、酵母浸膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；槐豆膠美國Sigma公司；酵母細(xì)胞壁 本實(shí)驗(yàn)室自制[12]；麩皮市售。

1.2 儀器與設(shè)備

PHX-DHS-X型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；YXQLD31-400型立式消毒鍋 上海江南容器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)SW-CJ-1F 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UV-2000分光光度計(jì) 上海安亭科學(xué)儀器廠；CR21G冷凍離心機(jī) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母細(xì)胞壁3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、瓊脂15g；活化培養(yǎng)基：酵母細(xì)胞壁3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、瓊脂15g；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母細(xì)胞壁8g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL；初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：水50%、麩皮40%、酵母細(xì)胞壁8%、NaCl 0.5%，初始接種量2%。

1.3.2 出發(fā)菌株篩選

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)異甘露聚糖酶的菌株進(jìn)行分離純化，將純化后的單個(gè)菌落點(diǎn)種到培養(yǎng)基上，37℃發(fā)酵24h后進(jìn)行產(chǎn)酶篩選，選取產(chǎn)酶活性較高且穩(wěn)定的菌株作為誘變育種的出發(fā)菌株。

1.3.3 菌懸液制備

將確定的出發(fā)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，至對(duì)數(shù)生長期后取菌液進(jìn)行離心，用無菌生理鹽水調(diào)整到濃度為108CFU/mL的細(xì)胞懸液備用。

1.3.4 致死曲線的繪制

每組取6mL菌懸液，放入直徑為9cm的平皿中，在黑暗中用15W紫外燈距離30cm在磁力攪拌器下分別照射0(對(duì)照組)、30、45、60、90、120、180s，將誘變后的菌液采用稀釋涂布法[13]涂布于平板上，稀釋梯度為10-1～10-7，取各劑量的 10-1、10-3、10-5、10-74 個(gè)梯度的細(xì)胞懸液0.1mL涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板，每個(gè)梯度涂2個(gè)，涂布后立即用黑牛皮紙包扎好，倒置37℃避光發(fā)酵24h。以未誘變菌液發(fā)酵后的菌落數(shù)為基準(zhǔn)計(jì)算不同誘變時(shí)間的致死率，以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)繪制殺菌曲線。

式中：n1為對(duì)照組的菌落總數(shù)/(CFU/mL)；n2為誘變處理后的菌落總數(shù)/(CFU/mL)。

1.3.5 紫外線誘變及篩選

選取致死率在80%～90%的紫外線照射時(shí)間作為最適處理劑量處理出發(fā)菌株。挑取突變菌株點(diǎn)種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，利用碘液進(jìn)行初篩，通過比較原始菌株的水解圈直徑與菌落直徑的比值(H/C)，篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的正突變菌株，選擇H/C相對(duì)較大的15株菌株利用DNS法進(jìn)一步復(fù)篩。紫外誘變后所有操作在紅燈下進(jìn)行，紫外線誘變每一次都是以此次誘變的前次誘變篩選出的酶活力增幅最大的菌株作為出發(fā)菌株，重復(fù)前面誘變及篩選的步驟。連續(xù)誘變11次。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定

將篩選出的突變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，分別測(cè)定各代菌株酶活力的大小，以測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.7 粗酶液的制備

取培養(yǎng)好的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基10g加入蒸餾水100mL，攪拌均勻后40℃保溫1h后過濾，取濾液3000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液[14]。

1.3.8 異甘露聚糖酶活力的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定酶活力[2]，用0.1mol/L檸檬酸和0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液配制成pH值為6.5的以酵母細(xì)胞壁為底物的溶液，酵母細(xì)胞壁的質(zhì)量濃度為0.5g/L。因?yàn)楹茈y制備得到純的酵母甘露聚糖，且酵母甘露聚糖在酵母細(xì)胞壁中是以糖蛋白的混合物形式存在，所以直接使用酵母細(xì)胞壁代替酵母甘露聚糖作為底物。取底物緩沖液0.9mL預(yù)熱至60℃，添加0.1mL的粗酶液，60℃反應(yīng)10min，加入1mL DNS試劑，然后在沸水浴中顯色5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10mL，搖勻，于540nm波長處測(cè)定OD值。異甘露聚糖酶活力的定義為：底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1μmolD-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.9 種子液的制備

將菌株接種到10mL活化培養(yǎng)基的試管中37℃發(fā)酵24h后，按照10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，37℃、200r/min振蕩發(fā)酵24h，得到的菌液即為種子液。

1.3.10 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在原固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇酵母細(xì)胞壁添加量和氮源及氮源添加量2個(gè)因素進(jìn)行了單因素梯度試驗(yàn)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化。

1.3.11 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

在原固態(tài)發(fā)酵條件下對(duì)發(fā)酵時(shí)間、接種量、p H值、料液比、裝料量5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化。通過固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后，采用以五因素四水平的正交試驗(yàn)來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配比和發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適誘變劑量的選擇

圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌致死率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on the death rate of Bacillus subtilis K-6

由圖1可知，紫外線誘變時(shí)間與產(chǎn)異甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌菌株的致死率之間存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著紫外線誘變時(shí)間的延長，存活率逐漸降低。誘變誘變時(shí)間較長時(shí)致死率越高，一般致死率在90%以上時(shí)，其單位存活細(xì)胞中的正突變菌株較少，負(fù)突變菌株較多。但當(dāng)致死率為80%～90%時(shí)，單位存活的細(xì)胞中正突變菌株較多[15]。當(dāng)誘變時(shí)間為90s時(shí)其致死率為82.3%，因此選擇誘變時(shí)間為90s作為誘變劑量。

2.2 誘變菌株的初篩與復(fù)篩

通過初篩選擇H/C相對(duì)較大的15株菌株通過DNS法進(jìn)一步復(fù)篩，以異甘露聚糖酶出發(fā)菌株編號(hào)為K-6-0為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液的異甘露聚糖酶活力。突變菌株4號(hào)酶活力最高為264.5U/mL，比出發(fā)菌株的酶活提高了28.4%，所以選擇4號(hào)突變菌株為第2次紫外誘變的出發(fā)菌株，以后的每一次誘變?nèi)缜笆霾襟E，經(jīng)11次紫外誘變后得到一株酶活力最高的突變菌株9號(hào)，其酶活力為349.3U/mL，高于出發(fā)菌株69.6%，將其命名為枯草芽孢桿菌K-6-9。

2.3 遺傳穩(wěn)定性

表1 突變菌株穩(wěn)定性的研究Table 1 Genetic stability of strain K-6-9

對(duì)紫外誘變得到的異甘露聚糖酶活力最高的K-6-9突變株進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性研究，將K-6-9突變株連續(xù)5代發(fā)酵，每傳一代均接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48h后測(cè)定酶活力。由表1可知，產(chǎn)異甘露聚糖酶菌株K-6-9突變株連續(xù)5代發(fā)酵后，酶活力范圍為343.0～350.3U/mL，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 突變株K-6-9固態(tài)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 自制酵母細(xì)胞壁添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 酵母細(xì)胞壁添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of yeast wall amount on the production of isomannanase

異甘露聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，研究表明酵母細(xì)胞壁中含有大量的異甘露聚糖，對(duì)異甘露聚糖酶具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。選用麩皮作為碳源，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上加入2%、4%、6%、8%、10%、12%不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的自制酵母細(xì)胞壁，以2%的接種量將種子液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中混勻，37℃發(fā)酵72h后測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖2所示。加入8%自制酵母細(xì)胞壁量時(shí)酶活力最高。酵母細(xì)胞壁對(duì)產(chǎn)酶有誘導(dǎo)作用，還作為碳源為菌株的生長提供能量，所以并不是碳源濃度越高對(duì)菌株的生長越有利，培養(yǎng)基中的碳源濃度過高也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫水而使代謝產(chǎn)物降低[16]。

2.4.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

選擇6種氮源，其添加量占固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的1%，以不添加氮源的為對(duì)照組。酵母細(xì)胞壁添加量8%，培養(yǎng)基其余成分不變，以2%的接種量將種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h后測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖3所示。利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析得知6種氮源對(duì)產(chǎn)酶量均有顯著差異(P＜0.05)，從而選取添加后其酶活力最高的氯化銨做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inorganic nitrogen sources on the production of isomannanase

2.4.3 裝料量對(duì)產(chǎn)酶的影響

氯化銨添加量5%、接種量2%，其余同初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。將15、20、25、30g固態(tài)培養(yǎng)基分別裝入250mL三角瓶中，37℃靜置發(fā)酵72h，固態(tài)發(fā)酵過程中，由于單位體積的固態(tài)培養(yǎng)基的堆積和高菌體濃度會(huì)促使微生物代謝產(chǎn)生了大量的熱量無法及時(shí)傳遞，而導(dǎo)致固態(tài)培養(yǎng)基中溫度的上升，需考慮調(diào)節(jié)裝料量使其盡量達(dá)到菌體的最佳生長狀況及最佳的產(chǎn)酶效果。

圖4 裝料量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of medium loading amount on the production of isomannanase

由圖4可知，在裝料量為25g/250mL時(shí)枯草芽孢桿菌酶活力最高，隨著裝料量的增加其酶活力迅速下降，說明固態(tài)培養(yǎng)基過多堆積使溫度上升，不適宜菌體的生長及酶的產(chǎn)生。

2.4.4 料液比對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基中水分含量對(duì)菌體的生長有很大的影響。培養(yǎng)基中的料水比應(yīng)適中，水分太高會(huì)使麩皮成團(tuán)，影響培養(yǎng)基的透氣性與散熱性，水分太低會(huì)影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解和傳遞[17]，也不能滿足菌體生長對(duì)水分的需求。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基裝料量25g/250mL、酵母細(xì)胞壁添加量8%、接種量2%，改變料液比分別為1:0.6、1:0.8、1:1.0、1:1.2、1:1.4、1:1.6，混勻后置37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h后測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖5所示，料液比為1:1.0時(shí)酶活力最高，對(duì)產(chǎn)酶最有利。

圖5 料液比對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on the production of isomannanase

2.4.5 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的料液比為1:1，其他組成及發(fā)酵條件不變，分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量將液態(tài)種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后37℃發(fā)酵72h后測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)接種量為3%時(shí)酶活力最高。因?yàn)榻臃N量過低會(huì)導(dǎo)致菌體生長緩慢，發(fā)酵周期延長；而過高則影響菌體生長過快，造成溫度升高過快從而影響酶的產(chǎn)生。

圖6 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on the production of isomannanase

2.4.6 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基分別用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)至pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，高壓滅菌后，以3%接種量將種子液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h后測(cè)定酶活力，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)pH7.0時(shí)酶活力最高，因此在pH7.0時(shí)最適宜菌體的生長及酶的產(chǎn)生。

圖7 pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of pH on the production of isomannanase

2.4.7 發(fā)酵溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

溫度不僅會(huì)影響菌體的生長、繁殖和新陳代謝，也會(huì)影響酶的產(chǎn)生及活性。菌體在生長繁殖期的對(duì)數(shù)期時(shí)其代謝活動(dòng)最旺盛，最利于酶的產(chǎn)生，因此要考慮發(fā)酵時(shí)間，使其達(dá)到最佳的產(chǎn)酶時(shí)間。在32、34、36、38℃條件下，分別用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵24、36、48、60、72、84、96、108h分別取樣，測(cè)定其酶活力，結(jié)果如圖8所示。在36℃發(fā)酵其酶活力最高，說明溫度偏低會(huì)使酶活力受到抑制[16]，細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)減弱。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加其產(chǎn)酶量也隨之增加，當(dāng)發(fā)酵至72h后隨著時(shí)間的增加產(chǎn)酶量有緩慢降低的趨勢(shì)，有可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間較長培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)完全消耗，菌體可以利用產(chǎn)生的酶可以作為碳源維持自身的需要，所以后期隨著時(shí)間的增加產(chǎn)酶量減少。因此選擇72h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖8 發(fā)酵溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature and time on production of isomannanase

2.4.8 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了裝料量為25g/250mL，無機(jī)氮源選取了氯化銨，剩余的5個(gè)因素設(shè)計(jì)按表2，以異甘露聚糖酶活力為指標(biāo)，進(jìn)行表2所示的L16(45)正交試驗(yàn)。

表2 L16(45)正交試驗(yàn)分析結(jié)果Table 2 L16(45) orthogonal array design arrangement and corresponding experimental results

由表2可知，正交試驗(yàn)16組中得出的最優(yōu)工藝組合為第12組。在此條件下，菌株產(chǎn)生的酶活力可達(dá)576.4U/mL。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析得到發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株的產(chǎn)酶能力影響最大，5個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響強(qiáng)度大小為：A＞C＞D＞E＞B，即發(fā)酵時(shí)間＞pH值＞酵母細(xì)胞壁添加量＞料液比＞接種量。菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)組合條件是：A3B3C3D2E3，即發(fā)酵時(shí)間為72h、接種量為3%、pH值為7.5、酵母細(xì)胞壁添加量8%、料液比為1:1.2。由于最優(yōu)組合并未出現(xiàn)在16組試驗(yàn)中，所以需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最優(yōu)組合A3B3C3D2E3獲得的酶活力為601.6U/mL，高于正交試驗(yàn)中出現(xiàn)的最高值576.4U/mL，所以選擇A3B3C3D2E3為最終發(fā)酵工藝條件。

3 結(jié) 論

產(chǎn)異甘露聚糖酶菌株在紫外線照射90s時(shí)致死率為82.3%，因此選擇誘變時(shí)間為90s作為誘變劑量。經(jīng)11次紫外誘變后通過初篩和復(fù)篩得到一株異甘露聚糖酶突變菌株K-6-9酶活最高為349.3U/mL，高于出發(fā)菌株69.6%。

經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化異甘露聚糖酶突變菌株K-6-9的固態(tài)發(fā)酵工藝條件，得出產(chǎn)酶的最適宜發(fā)酵條件為：pH7.5、裝液量25g/250mL、料液比為1:1.2、接種量為3%、發(fā)酵72h后測(cè)酶活力為601.6U/mL。

現(xiàn)文獻(xiàn)只有關(guān)于對(duì)β-甘露聚糖酶誘變育種及其固態(tài)發(fā)酵的報(bào)道[18]，異甘露聚糖酶的誘變育種及固態(tài)發(fā)酵條件的研究未見詳細(xì)報(bào)道。本研究固態(tài)發(fā)酵具有成本低廉、工藝簡單、操作粗放、能耗低、零污染等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

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Optimization of Mutation Breeding and Solid-State Fermentation Conditions for Isomannanase-Producing Strain

MU Zhao-yan1，WANG Li-ping1,*，ZHANG Da-bing2，LI An-xue1，WANG Xin1
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. School of Life and Technology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

In order to improve the activity of isomannanase,Bacillus subtilisK-6, a strain capable of secreting isomannanase,was subjected to mutation breeding through UV induction. A positive mutant strain was obtained and fermentation conditions for the production of isomannanase by it were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The isomannanase activity of the original strain was 206.0 U/mL, while that of the high-yield mutant strain K-6-9 was 349.3 U/mL,showing a 69.6% increase compared withBacillus subtilisK-6. The isomannanase activity of the fifth generation of K-6-9 varied from 343.0～350.3 U/mL, indicating good genetic stability. The optimal fermentation conditions for isomannanase production by K-6-9 were found as 72 h of fermentation time, 3% of inoculum size, initial pH 7.5, and 25 g/250 mL of medium filling percentage.The optimal fermentation medium was composed of 40% wheat bran, 8% yeast wall and material-to-liquid ratio 1:1.2.The maximum activity of K-6-9 strain reached up to 601.6 U/mL under the optimal fermentation conditions.

isomannanase；UV mutation；solid-state fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0220-06

2011-06-29

上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(J50704)；上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)創(chuàng)新項(xiàng)目(07ZZ137)

穆昭艷(1986—)，女，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：muzhaoyan0501@126.com

*通信作者：汪立平(1968—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄怨烟?、釀酒科學(xué)與技術(shù)及大豆精深加工。E-mail：lpwang@shou.edu.cn