趙 潔，徐 斐*，曹 慧，于勁松

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

水溶性有機(jī)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

趙 潔，徐 斐*，曹 慧，于勁松

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

從新鮮雞肝中提取出雞肝酯酶，并研究水溶性有機(jī)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響。結(jié)果表明：甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇-甲醚、乙二醇-乙醚在低體積分?jǐn)?shù)時(shí)對(duì)雞肝酯酶酶活力有激活作用，高體積分?jǐn)?shù)使其失活。乙二醇-甲醚能夠較好的保持雞肝酯酶活力，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，相對(duì)酶活力仍保持93%。丙酮和1,4-二氧六環(huán)對(duì)雞肝酯酶主要表現(xiàn)為失活作用，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，相對(duì)酶活力低于80%。

雞肝酯酶；酶活力；水溶性有機(jī)溶劑

雞肝酯酶是一種由上海理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究所從雞肝中提取的動(dòng)物酯酶，是用于農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)儀中的檢測(cè)工具酶，目前已有關(guān)于雞肝酯酶用于多種有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)的報(bào)道[1-3]。在農(nóng)藥速測(cè)過(guò)程中，利用有機(jī)溶劑提取農(nóng)藥是關(guān)鍵步驟之一，而有機(jī)溶劑的存在會(huì)對(duì)酶活力產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響檢測(cè)效果，因此研究有機(jī)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響尤為重要[4]。本實(shí)驗(yàn)以雞肝酯酶液酶為研究對(duì)象，研究幾種常用的水溶性有機(jī)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響，以期為今后選取農(nóng)藥提取劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞肝 上海沔青食品廠；固蘭B(fast blue-salt)美國(guó)Sigma公司；α-乙酸萘酯(色譜純)、檸檬酸、檸檬酸三鈉、十二烷基硫酸鈉、丙酮、甲醇、無(wú)水乙醇、正丙醇、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、1,4-二氧六環(huán)均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1型組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；超高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；722S型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；水浴搖床 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲波儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞肝酯酶的分離提取

將30.0g新鮮雞肝和90.0g的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(0.025mol/L的緩沖溶液，pH6.4)以1:3的比例混合，用組織搗碎機(jī)將上述混合物打成勻漿，為避免搗碎過(guò)程中溫度過(guò)高失去酶活力，先加入1/3的緩沖液進(jìn)行搗碎，待雞肝全部粉碎后，再加入剩余2/3緩沖液，每旋轉(zhuǎn)10s，停20s。重復(fù)5次。所得勻漿在冷凍離心機(jī)上以4℃、4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后，上清液即為雞肝酯酶，用脫脂棉過(guò)濾后，立即于－18℃凍藏備用。

1.3.2 雞肝酯酶酶活力的測(cè)定

根據(jù)van Asperen[5]所述方法改進(jìn)，參考徐斐等[2]對(duì)雞肝酯酶液酶酶活力的檢測(cè)方法，具體方法如下：將酶液用pH6.4的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液適當(dāng)稀釋。在2.5mL稀釋酶液中加入50μ L底物(16mmol/Lα-乙酸萘酯的丙酮溶液)混合均勻，在30℃恒溫水浴中保溫反應(yīng)5min，然后與0.5mL顯色劑(0.4%固蘭B的1.8% SDS溶液)混合均勻，再于30℃條件下保溫5min。以不加酶液的反應(yīng)液作空白，記錄595nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)下式計(jì)算雞肝酯酶液的活力。

式中：EL為酶液的雞肝酯酶酶活力/(U/mL)；D為酶液的稀釋倍數(shù)；K為α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(10-6mol/L)；A為反應(yīng)液的吸光度。

1.3.3 有機(jī)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

選擇甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮、1,4-二氧六環(huán)、乙二醇-甲醚、乙二醇-乙醚等水溶性有機(jī)溶劑為效應(yīng)物，在3mL的測(cè)定體系中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的效應(yīng)物，測(cè)定酶活力。以原來(lái)測(cè)得的酶活力記為E0，加入有機(jī)溶劑后測(cè)得的酶活力記為E1，用相對(duì)酶活力E1/E0分析研究效應(yīng)物對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響。

同時(shí)，以不含羥基的乙醚為效應(yīng)物，測(cè)定相對(duì)酶活力，以此作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，分析醇類、含羥基醚類有機(jī)溶劑在低體積分?jǐn)?shù)條件下激活雞肝酯酶酶活力的原因。

2 結(jié)果與分析

2.1 一元醇對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

圖1 3種一元醇對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響Fig.1 Effects of methanol, alcohol and propanol on the activity of chicken liver esterase

由圖1可知，3種水溶性一元醇對(duì)雞肝酯酶的效應(yīng)均表現(xiàn)為先激活后抑制作用，其中以正丙醇對(duì)雞肝酯酶酶活力影響最為明顯，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)對(duì)酶活力的激活作用達(dá)到最大，隨后迅速下降，25%時(shí)酶活力完全喪失。乙醇低于25%時(shí)對(duì)酶活力有激活作用，且該作用相對(duì)較平緩，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高變化不大；以25%為分界，高于25%雞肝酯酶酶活力迅速下降，當(dāng)乙醇到達(dá)40%時(shí)，酶活力完全喪失。甲醇為40%時(shí)仍然能夠保持原酶活力的120%。從3種醇類對(duì)酶活力的影響推斷該影響可能與碳鏈長(zhǎng)短有關(guān)。

2.2 2種含羥基醚對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

圖2 2種含羥基醚對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響Fig.2 Effects of EGME and glycol ether on the activity of chicken liver esterase

由圖2可知，乙二醇-乙醚和乙二醇-甲醚對(duì)雞肝酯酶酶活力都表現(xiàn)為先激活后抑制作用，且體積分?jǐn)?shù)在20%～25%區(qū)間激活作用達(dá)到最高值，在40%內(nèi)都能較好的保持酶活力。不同的是，乙二醇-乙醚大于40%后開(kāi)始對(duì)酶活力產(chǎn)生抑制作用，到體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)酶活力僅剩20%；而乙二醇-甲醚在體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)仍保持較好的酶活力，相對(duì)酶活力約為100%。

2.3 丙酮、1,4-二氧六環(huán)對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

圖3 丙酮、1,4-二氧六環(huán)對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響Fig.3 Effects of acetone and 1,4-dioxane on the activity of chicken liver esterase

由圖3可知，丙酮和1,4-二氧六環(huán)對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響類似，多數(shù)情況下表現(xiàn)為抑制作用。丙酮體積分?jǐn)?shù)小于5%時(shí)表現(xiàn)出輕微激活作用，隨后隨著體積分?jǐn)?shù)升高，酶活力迅速下降。1,4-二氧六環(huán)體積分?jǐn)?shù)小于5%時(shí)能夠保持酶活力在90%以上，但是高于5%后酶活力隨1,4-二氧六環(huán)體積分?jǐn)?shù)升高而迅速下降。

2.4 不含羥基醚(乙醚)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

圖4 乙醚對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響Fig.4 Effect of glyeol ether on the activity of chicken liver esterase

由圖4可知，乙醚在體積分?jǐn)?shù)低于25%時(shí)對(duì)雞肝酯酶酶活力表現(xiàn)為抑制作用，隨著體積分?jǐn)?shù)升高，酶活力逐漸降低。低體積分?jǐn)?shù)條件下，乙醚呈油狀小顆粒形態(tài)均勻分布在體系中，對(duì)雞肝酯酶酶活力并無(wú)激活作用，與含羥基醚類相比較作用完全不同，推斷可能與分子結(jié)構(gòu)中的羥基有關(guān)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)表明，正丙醇、乙醇、甲醇、乙二醇-乙醚、乙二醇-甲醚、丙酮、1,4-二氧六環(huán)有機(jī)溶劑對(duì)雞肝酯酶酶活力具有低體積分?jǐn)?shù)激活、高體積分?jǐn)?shù)抑制的作用。雞肝酯酶與多數(shù)酶一樣，在有機(jī)溶劑-水體系中可以發(fā)揮作用，而且在不同的有機(jī)溶劑中會(huì)表現(xiàn)出不同的催化活性；同一種溶劑中不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響不同[6-10]。在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)雞肝酯酶酶活力在有機(jī)溶劑-水體系中的變化及可能的原因做初步探討。

3.1 有機(jī)溶劑種類對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

醇類、含羥基醚類對(duì)雞肝酯酶酶活力的作用表現(xiàn)為先激活后抑制作用，而丙酮、1,4-二氧六環(huán)對(duì)酶活力的作用則以抑制為主、僅在體積分?jǐn)?shù)極低的情況下表現(xiàn)出輕微的激活；而不含羥基的醚溶劑乙醚對(duì)酶活力不具有激活作用，主要表現(xiàn)為抑制作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，推測(cè)醇和醚中所含的羥基可能對(duì)激活雞肝酯酶的酶活力起主要作用?；衔镏兴牧u基結(jié)構(gòu)不僅能夠通過(guò)氫鍵與酶蛋白表面分子相連，又能夠通過(guò)氫鍵與體系中的水相連，使酶的蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，酶活性得到保護(hù)，不致于受到溶劑奪取酶分子所含的結(jié)合水而失活[11-13]。而丙酮、1,4-二氧六環(huán)分子結(jié)構(gòu)中無(wú)羥基結(jié)構(gòu)，對(duì)雞肝酯酶酶活力作用表現(xiàn)為抑制作用，可能與溶劑本身結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3.2 雞肝酯酶對(duì)一元醇的耐受性

研究一元醇對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)雞肝酯酶處于低體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇溶劑中酶活力增加。只有當(dāng)這兩種有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)升高到一定程度時(shí)，酶活力才逐漸受到抑制。這與國(guó)內(nèi)學(xué)者黃小紅等[8-9]研究甲醇、乙醇對(duì)其他酶活力的影響結(jié)果一致。不同的是，黃小紅等研究的甲醇、乙醇對(duì)棉鈴蟲(chóng)N-乙酰氨基葡糖苷酶和Bt幾丁質(zhì)酶活力影響結(jié)果顯示，兩種酶酶活力下降50%時(shí)甲醇、乙醇的體積分?jǐn)?shù)為25%，而本實(shí)驗(yàn)中引起雞肝酯酶酶活力損失50%的甲醇、乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、35%，均比前者高。這說(shuō)明雞肝酯酶與其他酶相比，對(duì)甲醇、乙醇的耐受性較高。

3種一元醇對(duì)雞肝酯酶酶活力的失活作用以正丙醇最明顯，乙醇次之，甲醇第三，出現(xiàn)這種情況可能與碳鏈長(zhǎng)短有關(guān)。碳鏈越長(zhǎng)，溶劑中羥基的相對(duì)含量較少，所引起介質(zhì)中的介電常數(shù)相對(duì)較低，對(duì)酶活力保護(hù)作用較弱，酶也越容易失活，因此，3種醇中正丙醇對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響最大[14]。

3.3 有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)雞肝酯酶活力的影響

雞肝酯酶酶活力在較高濃度有機(jī)溶劑中受到抑制作用，這是由于有機(jī)溶劑存在時(shí)雞肝酯酶的分子構(gòu)象發(fā)生變化造成的[15]。酶分子中的疏水鍵對(duì)維持雞肝酯酶的三維結(jié)構(gòu)起著極其重要的作用，酶在水中以氫鍵、靜電力和疏水鍵等維持自身穩(wěn)定的三維構(gòu)象，并在酶分子表面形成一個(gè)極性水化層。當(dāng)引入有機(jī)溶劑后，高濃度的有機(jī)溶劑可能通過(guò)破壞水化層，使雞肝酯酶酶分子中維系構(gòu)象的次級(jí)鍵被破壞，從而改變?cè)撁傅臉?gòu)象，引起酶活力的下降。Griebenow等[16]用FTR定量地研究蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑-水混合體系中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)定溶菌酶和枯草桿菌蛋白酶在3種不同體積分?jǐn)?shù)的水溶性有機(jī)溶劑(乙腈、四氫呋喃、正丙醇)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隨著體積分?jǐn)?shù)上升，在60%的混合溶液中兩種酶的α折疊含量明顯減少。這說(shuō)明隨著溶液中有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到越嚴(yán)重的破壞，酶失活的趨勢(shì)增加，這也可能是有機(jī)溶劑影響雞肝酯酶酶活力的方式。

3.4 溶液極性對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響

有研究表明，有機(jī)溶液濃度越高，溶液極性越小，酶活力隨之減小[17]。溶液極性對(duì)雞肝酯酶酶活力的影響可能為：酶的帶電基團(tuán)與極性基團(tuán)一般分布在酶的表面上，非極性疏水基團(tuán)包埋于酶內(nèi)部，在極性較強(qiáng)的水溶液中，其處于熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)(即能量最低狀態(tài))。由于熱運(yùn)動(dòng)，雞肝酯酶在水溶液中的構(gòu)象存在著漲落與呼吸，可使酶內(nèi)部的非極性疏水基團(tuán)翻到表面[18-19]。翻出作用是一種熱力學(xué)非自發(fā)過(guò)程，需要很高的活化能，因此雞肝酯酶處于動(dòng)態(tài)平衡中，內(nèi)部的非極性疏水基團(tuán)翻出機(jī)率很小。當(dāng)水溶液中加入有機(jī)溶劑使溶液極性降低時(shí)，酶的穩(wěn)定性降低，雞肝酯酶內(nèi)部的非極性疏水基團(tuán)翻出到表面上所需的活化能減小，翻出機(jī)率增大，從而使酶的活力降低[20]。

有機(jī)溶劑水溶液中當(dāng)濃度較低時(shí)，雞肝酯酶酶活力受到激活，對(duì)于這種現(xiàn)象可能是由于雞肝酯酶在極性有微弱降低的體系中，內(nèi)部的非極性疏水基翻到表面上的機(jī)率適當(dāng)增大，酶柔性增加所致。而雞肝酯酶柔性增加，活力提高，酶的活力有所激活[21]。

有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響是酶工程研究的一個(gè)重要的領(lǐng)域。研究雞肝酯酶在有機(jī)溶劑-水體系中的活力變化，對(duì)建立新的雞肝酯酶檢測(cè)農(nóng)藥體系，選擇最佳有機(jī)溶劑作為農(nóng)藥提取劑與反應(yīng)介質(zhì)等，都具有重要的科研價(jià)值。

[1] 吳燕雯, 吳瑛, 徐斐, 等. 提高雞肝酯酶穩(wěn)定性的保護(hù)劑選擇[J]. 食品工業(yè)科技, 2005, 26(6): 84-85.

[2] 徐斐, 許學(xué)勤, 張慧君, 等. 雞肝酯酶在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(5): 237-240.

[3] 李思超, 徐斐, 趙潔, 等. 雞肝酯酶快速檢測(cè)氰戊菊酯農(nóng)藥的試驗(yàn)研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 42(2): 10-15.

[4] 張慧君. 酶法快速檢測(cè)果蔬中農(nóng)藥殘留的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 上海: 上海理工大學(xué), 2004.

[5] van ASPEREN K. A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method[J]. J Ins Physil, 1962, 8(4): 401-414.

[6] FAULDS C B, PEREZ-BOADA M, MARTINEZ A T. Influence of organic co-solvents on the activity and substrate specificity of feruloyl esterases[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(8): 3732-3736.

[7] TORRES S, MARTINEZ M A, CASTRO P A, et al. An organicsolvent-tolerant esterase from thermophilicBacillus licheniformisS-86[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(2): 896-902.

[8] 黃小紅, 陳清西, 王君, 等. 有機(jī)溶劑對(duì)棉鈴蟲(chóng)N-乙酰氨基葡糖苷酶活力的影響[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 34(1): 78-81.

[9] 黃小紅, 陳清西, 王君, 等. 有機(jī)溶劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2005, 11(1): 71-73.

[10] CASTRO G R. Enzymatic activities of proteases dissolved in organic solvents[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1999, 25(8/9): 689-694.

[11] SOLA M, MEYER J R. Stabilization against thermal inactivation promoted by sugars on enzyme structure and function: why istrehalose more effective than other sugars[J]. Arch BiochemBiophys, 1998, 60(1): 10-14.

[12] 區(qū)炳慶, 盧衛(wèi)紅. 幾種糖與氨基酸對(duì)鴨血紅細(xì)胞 SOD的保護(hù)作用[J].佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 27(1): 20-23.

[13] 楊學(xué)山, 楊孝樸, 付文力. 糖類對(duì)羊血超氧化物歧化酶活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(7): 100-103.

[14] 謝進(jìn)金, 陳朝陽(yáng), 史雄略. 羅非魚(yú)過(guò)氧化氫酶活性的初步研究[J]. 水利漁業(yè), 2006, 26(6): 16-18.

[15] 黃卓烈, 蘇婷, 巫光宏, 等. 甲醇對(duì)酵母過(guò)氧化氫酶活性的影響機(jī)理研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2003, 23(12): 103-106.

[16] GRIEBENOW K, KLIBANOV A M. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents[J]. J Am Chem Soc, 1996, 118(47): 11695-11700.

[17] 林建城, 王志鵬, 楊文杰, 等. 幾種效應(yīng)物對(duì)黑曲霉果膠酶活力的影響[J]. 云南師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 26(6): 48-51.

[18] 彭立鳳. 有機(jī)溶劑對(duì)酶催化活性和選擇性的影響[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2000,12(3): 296-304.

[19] 張濟(jì)龍, 張光先, 任紅勤. 溶液極性對(duì)H2O2酶活力的影響研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 21(2): 186-189.

[20] 謝曉蘭, 潘小芳, 龔麗芬, 等. 有機(jī)溶劑對(duì)豬紅細(xì)胞SOD的活力與構(gòu)象影響[J]. 泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010, 28(4): 47-50.

[21] 李學(xué)剛. 表面活性劑物理化學(xué)及其在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用[M]. 重慶: 西南師范大學(xué)出版社, 1997: 159-160.

Effects of Water-Soluble Organic Solvents on Activity of Chicken Liver Esterase

ZHAO Jie，XU Fei*，CAO Hui，YU Jin-song
(School of Medical Instrumentation and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093, China)

Chicken liver esterase, isolated from fresh chicken liver, is available for detecting pesticides. The effects of watersoluble organic solvents on the activity of chicken liver esterase were investigated. The results indicated that methanol, alcohol,propanol, ethylene glycol monomethyl ether (EGME) and glycol ether at low concentration could activate chicken liver esterase;in contrast, these organic solvents at high concentration could inactivate chicken liver esterase. Ethylene glycol monomethyl ether was the best organic solovent to maintain the activity of chicken liver esterase. When EGME concentration was 50%, the relative activity of chicken liver esterase remained 93%. Acetone and dioxane had negative effect on enzymatic activity. Acetone and dioxane at a concentration of 10% could result in 20% loss for relative activity of chicken liver esterase.

chicken liver esterase；enzymatic activity；organic solvents

TS201.6；TS201.2

A

1002-6630(2012)15-0216-04

2011-07-12

上海市科委生物醫(yī)藥專項(xiàng)(10391901500)；上海市農(nóng)委科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(2006第7-4號(hào))

趙潔(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)技術(shù)。E-mail：foxriver.fox@hotmail.com

*通信作者：徐斐(1972—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)技術(shù)。E-mail：xufei.first@263.net