聶 路,張建新*,李文學(xué),劉 胐
(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100)
豐年蟲水溶性蛋白的分離純化及體外抗氧化性研究
聶 路,張建新*,李文學(xué),劉 胐
(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100)
目的:對豐年蟲水溶性蛋白進(jìn)行分離純化,獲得體外抗氧化活性最好的水溶性蛋白組分,并測定其分子質(zhì)量。方法:豐年蟲水溶性粗蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、DEAE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化,對純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行體外抗氧化活性的研究,利用SDS-PAGE電泳測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。結(jié)果:豐年蟲水溶性蛋白經(jīng)DEAE-Sepharose FF離子交換層析,梯度洗脫得到4個(gè)洗脫峰(峰1~4),峰2的體外抗氧化活性最強(qiáng)。峰2經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析分離純化得到3個(gè)洗脫峰(峰2-1~2-3),峰2-1的體外抗氧化活性最強(qiáng)。利用SDS-PAGE對峰2-1進(jìn)行鑒定,得到單一蛋白條帶,純度較高,蛋白分子質(zhì)量為82.47kD。體外抗氧化活性比較,峰2-1遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于水溶性粗蛋白。結(jié)論:蛋白組分峰2-1體外抗氧化活性最強(qiáng),為單一蛋白組分,其分子質(zhì)量為82.47kD。
豐年蟲;水溶性蛋白;分離純化;抗氧化活性
豐年蟲(Eubranchipus vernalis),又名豐年蝦、咸水豐年蝦,是無甲目(Anostraca)甲殼動物。研究表明,豐年蟲富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),根據(jù)Saito法,對其蛋白質(zhì)進(jìn)行分類提取,發(fā)現(xiàn)水溶性蛋白的體外抗氧化活性最強(qiáng)[1]。本研究通過硫酸銨沉淀、透析、D E A ESepharose FF離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析分離純化豐年蟲水溶性蛋白,測定其羥自由基(·OH),超氧陰離子自由基(O2-·)和DPPH自由基清除率,研究豐年蟲水溶性蛋白的體外抗氧化活性,利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對所純化的蛋白進(jìn)行鑒定,為對豐年蟲蛋白質(zhì)全方位多用途開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 材料與試劑
豐年蟲,由陜西豐源生物科技有限公司提供。
DEAE-Sepharose FF纖維素、Sephadex G-100 西安沃爾森有限責(zé)任公司;石油醚、三羥甲基氨基甲烷(tris)、濃鹽酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸銨、聚乙二醇6000、考馬斯亮藍(lán)R250等均為分析純;SDS、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺均為電泳級。
1.2 儀器與設(shè)備
FA2004分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DF-101S恒溫磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KDC-40低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;ZDJ-4A型自動電位滴定儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司;UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;PM180R高速冷凍離心機(jī)、SIM-FD5505P真空冷凍干燥機(jī) 德國西門子公司;自KDY-9830動凱氏定氮儀Ketuo公司;層析柱(玻璃柱1.60cm×100cm、1.60cm×50cm) 自制;SBS-100數(shù)控記滴自動部份收集器、HL-2B數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;電泳槽(8.2cm×8.5cm) 北京市六一儀器廠;EPS-300型電泳儀上海民儀電子有限公司。
1.3 方法
1.3.1 豐年蟲脫脂粉的制備
豐年蟲經(jīng)60℃烘干至恒質(zhì)量,研缽冰浴2h,研磨過80目篩,用石油醚對豐年蟲進(jìn)行索氏提取脫脂,脫脂粉在室溫下風(fēng)干12h,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 豐年蟲水溶性蛋白質(zhì)的提取
根據(jù)Saito法[2],提取豐年蟲水溶性蛋白,取5g豐年蟲脫脂粉,加入10倍體積的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4),40℃攪拌提取120min,3500r/min離心20min,收集上清液。測定上清液中水溶性蛋白含量。蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法,參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》[3]。
在上清液中加入硫酸銨固體至飽和度為70%(0℃硫酸銨70%飽和度質(zhì)量濃度為472g/L),0℃放置30min,10000r/min離心10min,沉淀溶于0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4),在4℃條件下透析48h,冷凍干燥,所得即為水溶性蛋白[4]。
1.3.3 豐年蟲水溶性蛋白的分離與純化過程
豐年蟲水溶性蛋白提取液→硫酸銨分級沉淀(70%飽和度)→透析→DEAE-Sepharose FF離子交換層析→體外抗氧化活性測定→Sephadex G-100凝膠層析→體外抗氧化活性測定→SDS-PAGE電泳
1.3.4 DEAE-Sepharose FF離子交換層析
取20mg豐年蟲水溶性蛋白粗品,溶于2mL 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4),3000r/min離心10min,取上清液加入DEAE-Sepharose FF離子交換柱(1.6cm×50cm),先用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫未被吸附的蛋白質(zhì),再用含0.1~0.5mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)連續(xù)洗脫被吸附的蛋白質(zhì),洗脫速率1mL/min,每5mL收集一管,每種濃度洗脫100mL,280nm波長處逐管檢測,收集洗脫峰,用聚乙二醇6000反透濃縮洗脫峰,冷凍干燥[5]。
1.3.5 Sephadex G-100凝膠層析
取20mg經(jīng)DEAE-Sepharose FF離子交換層析后冷凍干燥樣品,溶于2mL 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4),3000r/min離心10min,取上清液加入Sephadex G-100凝膠柱(1.6cm×100cm),用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫,洗脫速率0.4mL/min,每4mL收集一管,洗脫液體積為柱體積3倍。280nm波長處逐管檢測,收集洗脫峰,用聚乙二醇6000反透濃縮洗脫峰,冷凍干燥[6]。
1.3.6 SDS-PAGE電泳分析
SDS-PAGE電泳采用不連續(xù)體系進(jìn)行。在蛋白質(zhì)樣品中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的SDS和β-巰基乙醇后,100℃水浴3min。分離膠12%,濃縮膠4%[7],電極緩沖液用Tris-甘氨酸電極緩沖液。用水-異丙酮-冰醋酸(體積比13:5:2)的0.1%考馬斯亮藍(lán)R250染色,水-乙醇-冰醋酸(體積比1 7:1:2)脫色。恒流電泳,濃縮膠電泳電流10mA,分離膠電泳電流20mA。濃縮膠電泳時(shí)間1h,分離膠電泳時(shí)間3h。采用低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為對照[8],計(jì)算純化后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量,溴酚藍(lán)為指示劑[9]。1.3.7 體外抗氧化活性測定
體外抗氧化研究主要選定·OH、O2-·和DPPH自由基。·OH清除率:參照水楊酸法[10];O2-·清除率:參照鄰苯三酚自氧化法[11];DPPH自由基清除率:參照Boonmee[12]、Brand-Williams[13]等的方法。
2.1 豐年蟲水溶性蛋白質(zhì)提取率
由表1可知,豐年蟲脫脂粉中總蛋白和水溶性蛋白含量分別占脫脂粉的60.18%和33.64%,水溶性蛋白占總蛋白的55.90%。
表1 豐年蟲脫脂粉中水溶性蛋白質(zhì)相對百分含量Table 1 Relative content of water-soluble protein in Eubranchipus vernalis
2.2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析
圖1 豐年蟲水溶性蛋白DEAE-Sepharose FF柱洗脫圖譜Fig.1 Purification profile of water-soluble protein from Eubranchipus vernalis on DEAE-sepharose fast flow anion-exchange column
由圖1可知,豐年蟲水溶性粗蛋白經(jīng)D E A ESepharose FF離子交換層析,用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)和0.1~0.3mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫,分別得到一個(gè)洗脫峰(峰1~4),0.4mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)和0.5mol/L NaCl-0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)沒有得到洗脫峰[14]。峰1直接被0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫下來,說明該部分蛋白質(zhì)不能為離子交換劑所吸附。隨著洗脫液離子強(qiáng)度的增大,與離子交換柱結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)也被洗脫下來,分別為峰2、峰3、峰4。分別收集這4個(gè)洗脫峰,用聚乙二醇6000濃縮,冷凍干燥備用。
2.3 DEAE-Sepharose FF離子交換層析的洗脫峰體外抗氧化活性測定
表2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析各峰組分體外抗氧化活性結(jié)果(±s, n=3)Table 2 Antioxidant activity of each fraction obtained by DEAE-sepharose fast flow anion-exchange chromatography(± s, n=3)
表2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析各峰組分體外抗氧化活性結(jié)果(±s, n=3)Table 2 Antioxidant activity of each fraction obtained by DEAE-sepharose fast flow anion-exchange chromatography(± s, n=3)
注:同列小寫字母不同,表示差異顯著(P<0.05);同列大寫字母不同,表示差異極顯著(P<0.01)。下同。
蛋白組分 ·OH清除率/%O2-·清除率/%DPPH自由基清除率/%峰1 11.15±0.35aA 40.48±0.68aA 40.93±0.74aA峰2 14.56±0.47bA 55.57±0.38bB 65.63±0.90bB峰3 7.63±0.33cB 38.39±0.33bB 29.49±0.35cC峰4 4.89±0.88dB 31.31±1.56cC 28.80±0.65cC
DEAE-Sepharose FF離子交換層析獲得的4個(gè)洗脫峰的凍干品,配制成0.05mg/mL蛋白質(zhì)溶液,測定其體外抗氧化活性。由表2可知,·OH、O2-·和DPPH自由基清除率的測定結(jié)果大小排序均為:峰2>峰1>峰3>峰4,峰2對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除率分別為14.56%、55.57%和65.53%。因此實(shí)驗(yàn)將大量收集峰2進(jìn)行下一步純化。
2.4 Sephadex G-100凝膠層析
葡聚糖凝膠分離蛋白質(zhì)根據(jù)分子篩原理,蛋白質(zhì)按分子質(zhì)量大小從大到小洗脫下來。Sephadex G-100凝膠層析見圖2。
圖2 Sephadex G-100分離純化峰2的洗脫圖譜Fig.2 Purification profile of Peak-2 on Sephadex G-100 gel permeation column
由圖2可知,Sephadex G-100凝膠層析分離純化峰2,出現(xiàn)3個(gè)蛋白峰(峰2-1、峰2-2和峰2-3),分別收集這3個(gè)洗脫峰,用聚乙二醇6000濃縮,冷凍干燥備用。2.5 Sephadex G-100凝膠層析洗脫峰體外抗氧化活性測定
Sephadex G-100凝膠層析獲得的3個(gè)洗脫峰凍干品,配制成0.05mg/mL蛋白質(zhì)溶液,測定其體外抗氧化活性。由表3可知,·OH清除率大小排序?yàn)椋悍?-1>峰2-3>峰2-2,而O2-·和DPPH自由基清除率的結(jié)果大小排序大致為:峰2-1>峰2-2>峰2-3,峰2-1對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除率分別為23.22%、58.35%和71.37%。因此對峰2-1采用SDS-PAGE電泳鑒定其分子質(zhì)量。
表3 Sephadex G-100凝膠層析各峰組分體外抗氧化活性測定Table 3 Antioxidant activity of each sub-fraction obtained by Sephadex G-100 gel permeation chromatography
2.6 SDS-PAGE電泳結(jié)果
圖3 峰2-1組分SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of Peak 2-1
由圖3可知,經(jīng)DEAE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-100凝膠層析后的蛋白質(zhì)樣品純度較高,是單一條帶。通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白對照,可以得到該蛋白條帶的分子質(zhì)量為82.47kD。
2.7 豐年蟲水溶性粗蛋白與峰2-1體外抗氧化活性比較
2.7.1 ·OH清除率比較
圖4 ·OH清除率測定結(jié)果Fig.4 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against hydroxyl free radicals
由圖4可知,豐年蟲水溶性粗蛋白和峰2-1對·OH都有抑制作用,且隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。比較水溶性粗蛋白和峰2-1,發(fā)現(xiàn)在不同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下,峰2-1的·OH清除率都要高于水溶性粗蛋白。抗氧化機(jī)理可能是蛋白質(zhì)提供的氫和·OH結(jié)合,形成穩(wěn)定的自由基并阻止了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。另外一種可能就是蛋白質(zhì)能夠和自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中必需的離子結(jié)合,從而阻止反應(yīng)進(jìn)行[15]。
圖5 ·清除率測定結(jié)果Fig. 5 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against superoxide anion free radicals
2.7.3 DPPH自由基清除率比較
圖6 DPPH自由基清除率測定結(jié)果Fig.6 Scavenging activity of Peak 2-1 and crude protein against DPPH free radicals
由圖6可知,豐年蟲水溶性粗蛋白和峰2-1對DPPH自由基清除率隨蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。比較它們的DPPH自由基清除率,發(fā)現(xiàn)峰2-1要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水溶性粗蛋白。
研究結(jié)果表明,豐年蟲水溶性粗蛋白經(jīng)DEAESepharose FF離子交換層析分離純化得到4個(gè)洗脫峰(峰1~4),體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,峰2的體外抗氧化活性最好。峰2經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析分離純化得到3個(gè)洗脫峰(峰2-1、峰2-2、峰2-3),體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,峰2-1的體外抗氧化活性最好。用SDS-PAGE電泳鑒定峰2-1,發(fā)現(xiàn)是單一蛋白組分,分子質(zhì)量為82.47kD。對豐年蟲水溶性粗蛋白和峰2-1進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn),比較它們的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)·OH、O2-·和DPPH自由基清除率,峰2-1都遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于水溶性粗蛋白。
[1] 聶路, 張建新, 彭鑫華, 等. 豐年蟲蛋白質(zhì)分類提取及抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(24): 26-30.
[2] 馮明珠, 何聰芬, 趙華, 等. 燕麥麩蛋白質(zhì)Osboren分類級SDS-PAGE電泳分析[J]. 食品工業(yè)科技, 2007(1): 77-79.
[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB5009.5—2010食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.
[4] 李爽, 王靜, 張穎. 蜂王幼蟲蛋白質(zhì)提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2006(1): 128-129.
[5] 郭曉娜, 姚惠源. 苦蕎麥抗腫瘤蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7): 462-465.
[6] 馮敏杰, 周惠明, 錢海峰. 鵝血中轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)的分離純化及其性質(zhì)[J]. 無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 23(1): 94-98.
[7] 蘇薇, 楊潔, 沈曉麗, 等. 驢乳中蛋白質(zhì)組分的分離純化與鑒定[J].食品科學(xué), 2010, 31(23): 44-48.
[8] 周毅峰, 唐巧玉, 周大寨, 等. 富鋅水溶性莼菜蛋白ZnP6B- G75- WPⅡ的分離純化與組成分析[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17): 88-90.
[9] 魏文志, 夏文水, 吳玉娟. 小球藻蛋白質(zhì)的分離、純化及抗氧化特性[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 16(2): 135-139.
[10] 左光明, 譚斌, 秦禮康. 苦蕎麩皮蛋白的提取分離及清除自由基作用研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(11): 269-273.
[11] 李順峰, 張麗華, 付娟妮, 等. 真姬菇子實(shí)體多糖體外抗氧化特性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(4): 302-305.
[12] BOONMEE A, SRISOMSAP C, KARNCHANATAT A, et al. An antioxidant protein inCurcuma comosaRoxb. Rhizomes[J]. Food Chemistry,2011, 124: 476- 480.
[13] BRAND-WILLIAMS W, CUVELIER M E, BERSET C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J]. LWTM - Food Science and Technology, 1995, 28: 25-30.
[14] 馬莉, 唐健元, 李祖?zhèn)? 等. 板藍(lán)根多糖分離純化及其性質(zhì)的研究[J].中草藥, 2007, 38(8): 1143-1146.
[15] CHEN Ruizhan, LIU Zhiqiang, ZHAO Jimin, et al. Antioxidant and immunobiologial activity of water-soluble polysaccharide fraction purified fromAcanthopanax senticosu[J]. Food Chemistry, 2011, 127: 434-440.
Antioxidant Activity of Water-Soluble Protein Purified fromEubranchipus vernalis
NIE Lu,ZHANG Jian-xin*,LI Wen-xue,LIU Fei
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
Objective: To isolate and purify water-soluble protein with the highest antioxidant activity fromEubranchipus vernalisand determine its molecular weight. Methods: Crude water-soluble protein fromEubranchipus vernaliswas extracted and purified by ammonium sulfate precipitation, salting out, ion-exchange column chromatography, DEAE-fast-flow Sepharose anion-exchange chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. The antioxidant activities of different protein fractions were compared and their molecular weights were determined by SDS-PAGE. Results: The prepared crude watersoluble protein was mainly composed of 4 fractions named as Peak-1, Peak-2, Peak-3 and Peak-4 in DEAE-Sepharose fast-flow column chromatography and Peak-2 revealed higher antioxidant activity than other 3 fractions. In addition, Peak-2 was mainly composed of 3 sub-fractions including Peak 2-1, Peak 2-2 and Peak 2-3 in Sephadex G-100 gel-permeation column chromatography.Peak 2-1 exhibited higher antioxidant activity than other 2 sub-fractions. Peak 2-1 was identified by SDS-PAGE to reveal a molecular weight of 82.47 kD. The antioxidant activity of Peak 2-1 was much higher than that of the crude protein extract.Conclusion: Peak 2-1 has obtained fromEubranchipus vernalisas the most antioxidant protein with a molecular weight of 82.47 kD.
Eubranchipus vernalis;water-soluble protein;purification;antioxidant activity
TS254.4
A
1002-6630(2012)15-0122-05
2011-07-08
國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2009A18)
聶路(1986—),男,碩士研究生,主要從事食品營養(yǎng)與安全研究。E-mail:liuxingynly@163.com
*通信作者:張建新(1959—),男,教授,碩士,主要從事食品營養(yǎng)與安全研究。E-mail:zhangjx59@foxmail.com