胡小露，劉 卉，魯 寧，劉 佳，高學(xué)玲,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省食品安全分析與檢測省級實驗室，安徽 合肥 230036)

HPLC法同時測定藍莓汁及其發(fā)酵酒中9種有機酸

胡小露1,2，劉 卉1，魯 寧1，劉 佳1，高學(xué)玲1,2,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省食品安全分析與檢測省級實驗室，安徽 合肥 230036)

采用高效液相色譜法測定藍莓汁及其發(fā)酵酒中有機酸含量。色譜條件為：色譜柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液(磷酸調(diào)pH值為2.0)；流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm；柱溫：室溫。通過該方法檢測藍莓汁及其發(fā)酵酒中9種主要有機酸：草酸、酒石酸、蘋果酸、異檸檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸，其平均回收率為99.52%，平均相對標準偏差為0.019%。

高效液相色譜；藍莓汁；藍莓酒；有機酸

藍莓，杜鵑花科(Ericaceae)，越桔屬(Vacciniumspp.)[1]，其果實中富含花色素苷[2-4]、酚酸[5-6]、有機酸等多種有效成分，具有降脂、抗癌、延緩衰老、防止血管瘤的發(fā)生、治療糖尿病、改善血液循環(huán)等功效[7-9]，其中有機酸不僅直接影響果汁及其果酒的感官品質(zhì)，同時對花色苷等物質(zhì)還具有保護作用。藍莓汁及其發(fā)酵酒中的有機酸有原料帶來的，也有發(fā)酵中代謝產(chǎn)生的，其有機酸的種類及含量因品種及其發(fā)酵方式不同而不同。

目前，有機酸含量的檢測方法較多[10-16]，但關(guān)于藍莓及其制品中多種主要有機酸的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)同時測定尚未見文獻報道。本實驗利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)定性檢測藍莓汁中幾種主要有機酸，再利用HPLC通過等度洗脫方法定量檢測藍莓汁及其發(fā)酵酒中主要有機酸含量，可有效地跟蹤藍莓汁及藍莓酒發(fā)酵過程中有機酸含量及其變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓 安徽懷寧藍莓種植基地，于－20℃凍藏；果膠酶(食品級，酶比活力18000U/g) 煙臺通商國際貿(mào)易有限公司；活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、異檸檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸對照品(純度＞99%) 上海精純試劑有限公司；甲醇(色譜純) 美國Tedia公司；磷酸二氫銨(分析純) 天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

600高效液相色譜儀 美國Waters公司；FA1104N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C型pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 樣品的制備方法

1.3.1 標準溶液制備

分別稱取草酸、酒石酸、蘋果酸、異檸檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸對照品50.0mg，用去離子水定容至10mL，配制成5g/L標準液，根據(jù)樣品中有機酸含量分別稀釋，經(jīng)0.45μm濾頭過濾進樣。以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣液的制備

取1mg/L藍莓原汁100μL，－80℃預(yù)凍，冷凍干燥24h，采用衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)＋三甲基氯硅烷(TMCS)對樣品進行衍生化處理，置120℃干燥50min，待GC-MS定性分析。

2mL藍莓原汁或藍莓酒，經(jīng)15000r/min離心20min，0.45μm濾頭過濾，待HPLC定量分析。

1.3.3 藍莓酒的發(fā)酵工藝流程

藍莓打漿→果膠酶酶解→取汁→糖、酸調(diào)整→接酵母菌→22℃發(fā)酵→藍莓酒

1.4 HPLC色譜條件

色譜柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；進樣體積5μL；檢測波長：210nm；流動相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液，磷酸調(diào)pH值為2.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準工作曲線的建立

分別吸取一定質(zhì)量濃度的有機酸對照品，過濾后進樣。以進樣量/(mg/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線，見表1，結(jié)果表明色譜工作穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

表1 9種有機酸的標準曲線方程Table 1 Regression equations of nine organic acids

2.2 GC-MS圖譜分析

2.2.1 GC-MS定性分析

按照1.3.2節(jié)方法對樣品進行預(yù)處理，采用GC-MS對藍莓汁中主要有機酸進行檢測，結(jié)果見圖1。藍莓汁中的草酸、檸檬酸、異檸檬酸、蘋果酸，其出峰時間分別為6.925、24.467、28.825、29.042min。

圖1 藍莓汁中主要有機酸的GC-MS圖Fig.1 GC-MS chromatogram of nine major organic acids in blueberry juice

2.2.2 HPLC定量分析

實驗選取不同濃度草酸、酒石酸、蘋果酸、異檸檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸9種有機酸制作混合標準溶液，混合標準溶液色譜圖見圖2A；同時檢測藍莓汁及其發(fā)酵酒樣，見圖2B、C。可知，9種有機酸的色譜峰分離度較高。

圖2 有機酸對照品(A)、藍莓汁樣品(B)和藍莓酒樣品(C)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of standard organic acids (A),blueberry juice (B) and blueberry wine (C)

2.3 精密度實驗

取9種有機酸對照品的混合溶液10mL，按1.4節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6次，分別計算有機酸峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，其平均RSD為0.15%(n＝6)。表明該儀器靈敏度高，可用于藍莓酒中有機酸的檢測。

2.4 重復(fù)性實驗

精密吸取一定量的藍莓酒樣品6份，經(jīng)離心、過濾處理后進樣分析，分別計算有機酸峰面積的相對標準偏差，得到平均RSD為0.35%(n＝6)，表明該檢測方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加標回收率實驗

采用加樣回收法，精確吸取一定量的藍莓酒樣品5份，分別加入一定濃度的有機酸對照品，經(jīng)離心、過濾處理后進樣檢測，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計算回收率，結(jié)果見表2，其中有機酸平均回收率為99.52%，平均RSD為0.019%(n＝5)?？梢姶朔椒ǖ臏蚀_度和精密度均良好，可應(yīng)用于藍莓果酒中有機酸含量的檢測。

2.6 方法的驗證

為進一步驗證方法的可靠性，采用此方法跟蹤檢測了不同發(fā)酵時期藍莓酒的有機酸含量，結(jié)果見圖3。對發(fā)酵結(jié)束后的藍莓酒每隔10d連續(xù)取樣4次，采用該方法檢測這不同時期藍莓酒中有機酸的含量，分離效果均較好，目標峰出峰前后無雜質(zhì)峰干擾，在樣品有機酸濃度較低的情況下，雜質(zhì)峰也未干擾目標物的檢測，且主要有機酸目標峰出峰時間穩(wěn)定、峰形尖銳、分離度高。

圖3 不同發(fā)酵時期藍莓酒有機酸系列圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of blueberry wine fermented for different days

表2 方法回收率測定結(jié)果Table 2 Recovery rates of this method for 9 organic acids

3 討論與結(jié)語

采用衍生化方法前處理樣品[17-19]，利用GC-MS法對藍莓汁中有機酸進行檢測時，只檢測出草酸、蘋果酸、異檸檬酸、檸檬酸4種主要有機酸，酒石酸未被檢出，可能是在樣品的低溫處理過程中，酒石酸以鉀鹽等形式析出而導(dǎo)致含量低于檢測限而未被檢測出。結(jié)合相關(guān)文獻[14-16]及GC-MS定性分析結(jié)果，選取草酸、酒石酸、蘋果酸、異檸檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸9種有機酸作為檢測目標，分析藍莓及其發(fā)酵酒的有機酸的含量。HPLC法測定藍莓汁及其藍莓酒中的有機酸含量時，由于各種有機酸的洗脫速度相近，導(dǎo)致出峰時間間隔小，實驗通過調(diào)整流動相組成及配比達到了分離效果。通過調(diào)整流動相NH4H2PO4的質(zhì)量濃度為4g/100mL，pH2.0時可達到較為理想的分離效果。

采用流動相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液(磷酸調(diào)pH值為2.0)；流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm；柱溫：25℃；色譜柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)。通過該方法，藍莓酒中含有的九種主要有機酸：草酸、酒石酸、蘋果酸、異檸檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸得到有效的分離并定量，其平均回收率為99.52%，平均RSD為0.019%。結(jié)果顯示，該方法操作簡單，準確度高，無雜質(zhì)干擾，藍莓酒樣品無需經(jīng)過復(fù)雜的前處理，即可達到良好的分離效果。

[1] HASHIM J. Blueberry production gaining in California[M]. Texas:West Farm Press, 2004.

[2] CAMIRE M E, CHAOVANALIKIT A, DOUGHERTY M P, et al.Blueberry and grape anthocyanins as breakfast cereal colorants[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(1): 438-441.

[3] 王秀菊, 杜金華, 馬磊. 藍莓酒渣中花色苷提取工藝的優(yōu)化及其穩(wěn)定性的研究[J]. 分離與提取, 2009, 35(9): 151-156.

[4] PRIOR R L, LAZARUS S A, CAO Guohua, et al. Hammerstone.Identification of procyanidins and anthocyanins in blueberries and cranberries (Vacciniumspp.) using high performance liquid chromatography/mass spectrometry[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2001,49(3): 1270-1276.

[5] 翁芳華, 陳建業(yè), 溫鵬飛, 等. 藍莓酒中11種酚酸的高效液相色譜測定[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(9): 223-225.

[7] PRIOR R L, WU Xianli, GU Liwei, et al. Whole berries versus berry anthocyanins: interactions with dietary fat levels in the C57BL/6J mouse model of obesity[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2008,56(3): 647-653.

[8] YI Weiguang, AKOH C C, FISCHER J, et al. Absorption of anthocyanins from blueberry extracts by Caco-2 human intestinal cell monolayers[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2006, 54(15): 5651-5658.

[9] 胡雅馨, 李京, 惠伯棣. 藍莓果實中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10): 600-602.

[10] PHILLIPS M M, CASE R J, RIMMER C A, et al. Determination of organic acids in Vaccinium berry standard reference materials[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 398(1): 425-434.

[11] 韋壽蓮, 劉君紅, 郭海福, 等. 毛細管電泳對葉下珠中有機酸的分離檢測[J]. 分析測試學(xué)報, 2009, 28(6): 692-696.

[12] 楊朝霞. 有機酸分析方法之比較[J]. 釀酒科技, 2009, 141(9): 18-20.

[13] 李小平, 姚潯平, 陳曉紅, 等. 有機酸檢測的固相萃取方法研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(6): 981-983.

[14] ROMERO R, GZQUEZ D, BAGUR M.G, SNCHEZ-VIAS M.Optimization and validation method for organic acid determination in wines by high performance liquid cromatography[J]. Quim, 2010, 33(5):1186-1189.

[15] MANCINI F, MINIATI E, MONTANARI L. Determination of organic acid anions in Italian beers by a new HPLC method[J]. Ital Journal of Food Science, 2000, 12(4): 443-445.

[16] FAN-CHIANG H J, WROLSTAD R E. Sugar and nonvolatile acid composition of blackberries[J]. Journal of Aoac International, 2010, 93(3): 956-965.

[17] 楊世民, 何科學(xué). 植物激素提純中去除色素的有效方法研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1996, 14(4): 613-615.

[18] 任清. 衍生化-毛細管氣相色譜法同時測定飼料添加劑中富馬酸、乳酸和檸檬酸[J]. 分析化學(xué), 2002, 30(3): 304-306.

[19] 劉天煦. 氣相色譜法的衍生化技術(shù)[J]. 試劑與精細化學(xué)品, 2006(1):8-10.

Determination of 9 Organic Acids in Blueberry Juice and Wine by HPLC

HU Xiao-lu1,2，LIU Hui1，LU Ning1，LIU Jia1，GAO Xue-ling1,2,*
(1. College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China ；2. Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety, Hefei 230036, China)

A simple HPLC method was developed to determine organic acids (oxalic, tartaric, malic, isocitric, shikimic, lactic,acetic, citric and succinic acids) in blueberry juice and wine. The HPLC separation was achieved on C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at room temperature. The mobile phase (pH 2.0) was 4% NH4H2PO4 at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set as 210 nm. The average recovery rate of this method was 99.52% with RSD of 0.019%.

HPLC；blueberry juice；blueberry wine；organic acid

O657.7

A

1002-6630(2012)16-0229-04

2011-07-26

胡小露(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：355507989@qq.com

*通信作者：高學(xué)玲(1967—)，女，副教授，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：1223799045@qq.com