祝儒剛，宋立峰

(1.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，沈陽市食品生物加工與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110122)

肉及肉制品中沙門氏菌活細(xì)胞的PCR檢測研究

祝儒剛1，宋立峰2

(1.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，沈陽市食品生物加工與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧經(jīng)濟(jì)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110122)

將熒光染料疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)與普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)結(jié)合，通過對PMA的曝光時間、濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定PMA-PCR區(qū)別死活細(xì)胞的最佳條件，并制作活細(xì)胞定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立肉及肉制品中沙門氏菌活細(xì)胞的PMA-PCR檢測方法。結(jié)果表明：使插入死細(xì)胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游離PMA的最佳曝光時間為15min；不抑制沙門氏菌活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大PMA質(zhì)量濃度為10μg/mL；完全抑制熱致死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小PMA質(zhì)量濃度為4μg/mL。經(jīng)PMA處理，含有不同比例的沙門氏菌熱致死細(xì)胞和活細(xì)胞的混合液中活的沙門氏菌能夠通過PCR被選擇性的檢測，最小檢測限為20CFU/PCR。而且，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在20～2×105CFU/PCR范圍內(nèi)，電泳條帶相對熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)的對數(shù)具有線性關(guān)系。采集30份肉及肉制品樣品，利用PMA-PCR方法檢測出兩份生肉樣品中存在沙門氏菌，經(jīng)過6h的富集培養(yǎng)后的活菌濃度分別為2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。

肉及肉制品；沙門氏菌；活細(xì)胞；PMA-PCR

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科的一類革蘭氏陰性腸道桿菌，是細(xì)菌性食物中毒中發(fā)病率最高的一種。有資料顯示，我國細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的，而在引起沙門氏菌中毒的食品中，以肉及肉制品的污染最為嚴(yán)重，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)已將沙門氏菌列入具有嚴(yán)重危害和中等危害的食物傳播性病原[1-4]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)以其自身特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成各類食品中病原菌快速檢測的最主要的手段[5]。然而，PCR技術(shù)不能區(qū)分所檢測到的病原菌是活菌細(xì)胞還是死菌細(xì)胞，容易導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性，從而導(dǎo)致生產(chǎn)的大量浪費(fèi)。疊氮溴化乙錠(ethidium bromide mo noa z id e，EMA)和疊氮溴化丙錠(p ro pid iu m monoazide，PMA)是兩種對DNA具有高度親和力的光敏染料，能夠選擇性地穿透死菌細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，并且插入細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上[6-8]。隨后在強(qiáng)光作用下，已經(jīng)插入到細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上的EMA或者PMA可與DNA雙螺旋發(fā)生交叉偶合作用，阻止了以此DNA為模版的PCR反應(yīng)的進(jìn)行。但由于EMA的細(xì)胞毒性較大，其應(yīng)用受到較大的限制[9]。

本研究擬將無細(xì)胞毒性的PMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，建立肉及肉制品中沙門氏菌活細(xì)胞的定性及定量檢測方法，并通過采集實(shí)際樣品，運(yùn)用該方法對肉及肉制品中的沙門氏菌活細(xì)胞進(jìn)行定量檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌ATCC43975標(biāo)準(zhǔn)菌株 本實(shí)驗(yàn)室保存。

PMA(propidium monoazide) 美國Sigma公司；Taq酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑 大連寶生物工程有限公司；營養(yǎng)肉湯(牛肉膏3g，蛋白胨5g，加水至1000mL，pH7.2～7.4)。

C-1000梯度PCR儀、Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；CDYCP-31D電泳儀、電泳槽 北京六一儀器廠；752N紫外-可見分光光度計、500W鹵鎢燈 上海天普分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌熱處理

將沙門氏菌過夜培養(yǎng)，取菌懸液1mL，10000r/min離心1min收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于生理鹽水中。平板計數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度為4×108CFU/mL，將0.5mL沙門氏菌菌懸液于95℃水浴處理10min，充分冷卻后將菌懸液全部涂T1N3平板，37℃條件下恒溫培養(yǎng)48h，觀察是否有活菌存在[10]。

1.2.2 PMA曝光時間確定

將PMA溶液(0.1mg/mL)加入9支分別裝有0.5mL熱致死沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)的離心管中，使每管PMA終質(zhì)量濃度達(dá)到4μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置5min，使PMA充分滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并且與DNA雙螺旋進(jìn)行不可逆結(jié)合。將離心管開蓋置于冰上，距離燈管16cm，分別曝光0、5、10、15、20、25、30、35、40min。陽性對照不加PMA，陰性對照不加沙門氏菌菌懸液[11]。

1.2.3 不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大PMA質(zhì)量濃度確定

9只完全一樣的離心管，每只中取0.5mL活細(xì)胞菌懸液(4×108CFU/mL)，分別加入PMA溶液(1mg/mL)使其終質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15、20、25、30、35、40μg/mL?；靹蚝笫覝叵潞诎抵蟹胖眉s5min。離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，曝光15min。陽性對照不加PMA，陰性對照不加沙門氏菌菌懸液。

1.2.4 完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小PMA質(zhì)量濃度確定

10只完全一樣的離心管，每只中取0.5mL熱致死沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)，分別加入PMA溶液(1mg/mL)使其終質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL，處理方法如1.2.3節(jié)所述。陽性對照不加PMA，陰性對照不加沙門氏菌菌懸液。

1.2.5 PMA抑制熱致死沙門氏菌細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增能力測定

如表1所示，3組分別由活細(xì)胞和熱致死細(xì)胞混合而成的菌懸液：第1組由0.25mL固定數(shù)量(5×107CFU/mL)的熱致死細(xì)胞菌懸液與0.25mL變化數(shù)量的活細(xì)胞菌懸液(生理鹽水漂洗)混合；第2組由0.25mL滅菌生理鹽水與0.25mL變化數(shù)量的活細(xì)胞菌懸液(生理鹽水漂洗)混合，作為第1組的對照；第3組由0.25mL固定數(shù)量(5×107CFU/mL)的活細(xì)胞菌懸液(經(jīng)生理鹽水漂洗)與0.25mL變化數(shù)量的熱致死細(xì)胞菌懸液混合。

表1 死活細(xì)胞混合比例Table 1 Mix proportion of viable and dead cells

每個樣品中加入PMA(0.1mg/mL)溶液，使其終質(zhì)量濃度為4μg/mL。依1.2.3節(jié)方法處理后，10000r/min離心收集菌體，重懸于0.5mL的生理鹽水中，再次離心收集菌體，加50μL生理鹽水懸浮。

1.2.6 肉及肉制品中沙門氏菌活細(xì)胞檢測

樣品采自沈陽市各肉菜市場和超市，包括生肉10份(鮮肉、肝等)、熟肉制品10份(正規(guī)包裝和非包裝)、肉腸10份(正規(guī)包裝和非包裝)。生肉和非包裝樣品用專用的無菌采集袋采集，跟預(yù)先準(zhǔn)備好的冰袋一起迅速送回分析實(shí)驗(yàn)室，并在24h內(nèi)做分析處理。

1.2.7 DNA 模板制備

DNA提取采用TZ裂解液(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，2.5mg/mL 的疊氮化納，2.0% Triton X-100，pH8.0)法[12]。

各樣品菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴處理10min，室溫下冷卻，8000r/min離心5min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作PCR模板。

1.2.8 引物及PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的沙門氏菌invA基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計一對PCR引物，上游引物(P1)為：5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′，下游引物(P2)為：5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3′，擴(kuò)增片段長度284bp。PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL，DNA模板4μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，各引物均為10pmol，MgCl2(25mmol/L)2μL，Taq酶0.2μL，用滅菌水補(bǔ)足到25μL體系。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5min，94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 2min，29個循環(huán)，最后72℃延伸10min。1.2.9 PCR產(chǎn)物檢測及定量分析

1.5%瓊脂糖凝膠電泳(6V/cm，1h)檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。各DNA條帶的相對熒光強(qiáng)度用NIH 1.61圖像分析軟件進(jìn)行相對定量分析，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌熱處理時間

第五，學(xué)習(xí)型團(tuán)隊能提高學(xué)習(xí)效率。學(xué)霸寢室學(xué)生的學(xué)習(xí)成績居于班級前列，但并不意味著他們高考成績一定最為優(yōu)異。大學(xué)期間，他們之所以表現(xiàn)出眾，其中非常重要的原因在于他們?nèi)谌肓艘粋€學(xué)習(xí)團(tuán)隊，團(tuán)隊成員是他們朝夕相處的室友，他們之間雖然有原生家庭帶來的差異，但這些差異并不會給團(tuán)隊合作造成多少負(fù)面影響，他們相互激勵和啟發(fā)，你追我趕，因此學(xué)習(xí)效率很高，為日后成為棟梁之才打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。

沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)經(jīng)95℃水浴加熱10min，冷卻，涂平板37℃培養(yǎng)48h，無菌落生長。因此，95℃水浴處理10min，可殺死菌懸液(4×108CFU/mL)中所有沙門氏菌活細(xì)胞。

2.2 PMA最佳曝光時間

熱致死沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)經(jīng)PMA(終質(zhì)量濃度4μg/mL)處理，分別曝光0～40min后，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳圖譜及對應(yīng)的相對熒光強(qiáng)度柱狀圖如圖1所示。隨著曝光時間的延長，PCR擴(kuò)增條帶逐漸變?nèi)酰?dāng)曝光時間延長到15min時熒光條帶完全消失，其對應(yīng)的相對熒光強(qiáng)度值為0，熱致死沙門氏菌DNA的PCR擴(kuò)增被完全抑制。因此，在此研究中使熒光染料PMA光活化插入熱致死沙門氏菌DNA并且光解過剩的游離PMA的最佳曝光時間為15min。

圖1 激活和完全光解游離PMA的最佳曝光時間確定Fig.1 Determination of optimal light exposure time to activate and achieve complete photolysis of free PMA

2.3 不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大PMA質(zhì)量濃度

當(dāng)PMA質(zhì)量濃度過大時，沙門氏菌活細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增也會受到不同程度的抑制作用，見圖2A。沙門氏菌活細(xì)胞菌懸液中，隨著PMA質(zhì)量濃度的不斷增大，PCR擴(kuò)增條帶的熒光強(qiáng)度也有不同程度的降低(圖2B)。對柱狀圖進(jìn)行統(tǒng)計分析表明，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度小于等于10μg/mL時，PMA對活細(xì)胞PCR擴(kuò)增沒有明顯抑制作用(P＞0.05)。然而，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度增加到15μg/mL時，PMA對活細(xì)胞的PCR擴(kuò)增有顯著的抑制作用。因此，在本實(shí)驗(yàn)中選擇不抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最大PMA質(zhì)量濃度為10μg/mL。

圖2 不抑制活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大PMA質(zhì)量濃度確定Fig.2 Determination of maximum concentration of PMA without inhibiting amplification of DNA from viable cells

2.4 完全抑制死細(xì)胞PCR擴(kuò)增的最小PMA質(zhì)量濃度

圖3 完全抑制死菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小PMA質(zhì)量濃度的確定Fig.3 Determination of minimum concentration of PMA to completely inhibit amplification of DNA from heat-killed cells

如圖3所示，對于熱致死沙門氏菌細(xì)胞，隨著PMA質(zhì)量濃度的不斷增大，PCR擴(kuò)增條帶越來越弱，當(dāng)PMA的終質(zhì)量濃度等于或者大于4μg/mL時，電泳圖譜上沒有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，其對應(yīng)的相對熒光強(qiáng)度值為0，即熱致死細(xì)胞的PCR擴(kuò)增被完全抑制。此時，4μg/mL的PMA質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可以抑制活細(xì)胞PCR擴(kuò)增的PMA質(zhì)量濃度10μg/mL。

2.5 PMA抑制熱致死沙門氏菌細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增能力確定

由定量的死菌細(xì)胞與變化量的活菌細(xì)胞以及對照組生理鹽水與變化量的活菌細(xì)胞的PCR擴(kuò)增電泳圖譜如圖4所示。當(dāng)PMA質(zhì)量濃度為4μg/mL時，死菌細(xì)胞的PCR擴(kuò)增完全被抑制，活菌細(xì)胞的PCR沒有受到影響，DNA條帶的相對熒光強(qiáng)度隨著活細(xì)胞數(shù)(2×106、2×105、2 × 104、2 × 103、1 × 103、2 × 102、1 × 102、20CFU/PCR)的減少而逐漸減弱，檢測限能達(dá)到20CFU/PCR。而且，由圖4C可知，在20～2×105CFU/PCR體系范圍內(nèi)，DNA條帶的相對熒光強(qiáng)度與每個PCR反應(yīng)體系中所存在的活細(xì)胞菌落數(shù)的對數(shù)值呈現(xiàn)線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)可以相對熒光強(qiáng)度來對每個PCR體系中的活菌數(shù)進(jìn)行定量。

圖4 PMA抑制熱致死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增能力及對活細(xì)胞的定量曲線Fig.4 Inhibitory capability of PMA against PCR amplification of DNA derived from heat-killed cells and quantitative curve for viable cells

圖5 固定量的活細(xì)胞與變化量的熱致死細(xì)胞混合液的PMA-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PMA-PCR amplification derived from mixtures with a constant number of viable cells and various numbers of dead cells

定量的活細(xì)胞與變化量的熱致死細(xì)胞混合液中(圖5)，死細(xì)胞的PCR擴(kuò)增完全被PMA抑制，活細(xì)胞的PCR沒有受到影響。因此，對應(yīng)PCR擴(kuò)增電泳圖譜每個條帶的亮度均勻一致，其對應(yīng)相對熒光強(qiáng)度值也無顯著差異。

2.6 肉及肉制品樣品中沙門氏菌活細(xì)胞檢測

分別利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和PMA-PCR技術(shù)對30份肉及肉制品樣品進(jìn)行了沙門氏菌活細(xì)胞檢測。結(jié)果表明，經(jīng)過6h的富集培養(yǎng)后，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和PMAPCR法均檢測出兩份生肉樣品中含有沙門氏菌活細(xì)胞。利用圖4C的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，6h富集后的菌濃度分別為2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。

3 結(jié) 論

隨著社會的發(fā)展和人類文明的進(jìn)步，人們對食物品質(zhì)的要求越來越高，因此準(zhǔn)確、快速地檢測食品中的沙門氏菌，對于預(yù)防人類沙門氏菌感染具有十分重要的意義[13-14]。

本研究將熒光染料PMA應(yīng)用于普通PCR技術(shù)，利用PMA不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜卻能夠滲透到細(xì)胞壁或細(xì)胞膜不完整的死細(xì)胞體內(nèi)的特性，使其插入DNA并與其共價結(jié)合，從而抑制死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，而活細(xì)胞的PCR擴(kuò)增不受影響，更加精確地檢測肉及肉制品中沙門氏菌活細(xì)胞的存在。結(jié)果表明，當(dāng)PMA質(zhì)量濃度不低于4μg/mL時，可以完全抑制沙門氏菌死細(xì)胞DNA的PCR擴(kuò)增，高于擬桿菌的2.2μg/mL和大腸桿菌的3μg/mL，但是明顯低于軍團(tuán)藻的8.8μg/mL。當(dāng)PMA質(zhì)量濃度小于10μg/mL時，PMA不會對活細(xì)胞PCR擴(kuò)增產(chǎn)生顯著影響，此時的PMA質(zhì)量濃度比大腸桿菌的20μg/mL、軍團(tuán)藻的17.6μg/mL以及擬桿菌的10.5μg/mL 都要低[15-17]。

變化量的活菌細(xì)胞與定量的死菌細(xì)胞混合液，經(jīng)EMA處理后，在20～2×105CFU/PCR范圍內(nèi)，沙門氏菌活細(xì)胞DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的相對熒光強(qiáng)度與每個PCR反應(yīng)體系中所存在的活細(xì)胞DNA的拷貝數(shù)的對數(shù)值呈現(xiàn)嚴(yán)格的線性關(guān)系，據(jù)此可對各種肉及肉制品中的沙門氏菌活細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

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Detection of ViableSalmonellaCells in Meat and Meat Products by PCR

ZHU Ru-gang1，SONG Li-feng2
(1. Shenyang Key Laboratory of Food Biology Processing and Quality Control Technology, Engineering Technology Research Center for Food Biology Processing of Liaoning Province, College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China；2. Liaoning Economic Management Cadre Institute, Shenyang 110122, China)

A method for the selective detection of viable cells ofSalmonellain meat and meat products was developed using propidium monoazide (PMA) staining in combination with conventional PCR (PMA-PCR). Exposure time and PMA concentration were optimized to find optimal PMA-based PCR conditions for distinguishing between dead and viable cells. The results showed that the optimal light exposure time to activate PMA in dead cells and to photolyze free PMA in solution was 15 min.PMA at a dose of 10 μg/mL or less could not inhibit PCR amplification of DNA derived from viable cells ofSalmonella. The minimum concentration of PMA to completely inhibit PCR amplification of DNA derived from heat-killed cells was 4 μg/mL.After PMA treatment, viableSalmonellacells in a mixture containing different proportions of viable and dead cells could be selectively detected by PCR, and the minimum detection level was 20 CFU/PCR. An excellent linear relationship was observed between relative fluorescent intensity of DNA bands and lgCFU in the range of 20 － 2 × 105CFU/PCR. Among 30 meat and meat product samples, two samples were detected by the developed PMA-PCR method as being positive after 6 h enrichment with average amounts of 2.5 × 103CFU/mL and 3.4 × 103CFU/mL for viableSalmonellacells, respectively.

meat and meat products；Salmonella；viable cells；propidium monoazide-based polymerase chain reaction(PMA-based PCR)

TS201.6

A

1002-6630(2012)16-0199-05

2011-11-11

遼寧大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2009LDQN21)

祝儒剛(1980—)，男，講師，博士，研究方向食品微生物與分子生物學(xué)。E-mail：zrg_luck@163.com