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        固相萃取-流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定動(dòng)物肝臟中的鹽酸二氟沙星

        2012-10-27 07:35:32朱盈蕊高向陽(yáng)
        食品科學(xué) 2012年16期

        朱盈蕊,高向陽(yáng)*,趙 琛

        (河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

        固相萃取-流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定動(dòng)物肝臟中的鹽酸二氟沙星

        朱盈蕊,高向陽(yáng)*,趙 琛

        (河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

        堿性條件下,基于鹽酸二氟沙星對(duì)魯米諾-過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的抑制作用,樣品經(jīng)固相萃取柱處理后用該體系測(cè)定,建立快速分析豬肝、雞肝中鹽酸二氟沙星的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光新方法。結(jié)果表明:鹽酸二氟沙星質(zhì)量濃度在1.00×10-5~1.00×10-9mg/mL范圍內(nèi),質(zhì)量濃度的負(fù)對(duì)數(shù)與體系的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系,方法檢出限為4.07×10-9mg/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.93%(n=11)。該方法用于動(dòng)物肝臟中鹽酸二氟沙星殘留的檢測(cè),結(jié)果令人滿意。

        鹽酸二氟沙星;流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法;動(dòng)物肝臟;固相萃取

        鹽酸二氟沙星(difloxacin hydrochloride,DIF)是一類動(dòng)物專用氟喹諾酮類藥物,具有抗菌譜廣、殺菌效強(qiáng)、口服吸收迅速、半衰期長(zhǎng)、與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性、低毒、高效等特點(diǎn),對(duì)畜禽呼吸道致病菌有良好的抗菌活性,主要用于治療豬和禽類的敏感細(xì)菌及支原體所致的各種感染性疾病[1-2],該類藥物的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]??咕幰蚱渲委熜Ч麅?yōu)異,廣泛應(yīng)用于疾病的預(yù)防和控制,其中包括氟喹諾酮類藥物。隨著該類藥物使用量的增大,各種毒副作用逐漸顯現(xiàn),會(huì)引起惡心、嘔吐、頭痛、心悸等直接毒性反應(yīng),還可引起光毒性皮炎,而逐漸受到人們的高度關(guān)注,國(guó)家農(nóng)業(yè)部對(duì)動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量做了規(guī)定[6]。因此,研究鹽酸二氟沙星在動(dòng)物性食品中的殘留,對(duì)保障食品安全和維護(hù)人體健康有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

        目前,二氟沙星殘留的主要分析方法有高效液相色色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]、超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-13]、高效液相色譜法[14]、酶聯(lián)免疫法[15-16]等。前兩種方法設(shè)備昂貴,酶聯(lián)免疫法操作復(fù)雜,有時(shí)無(wú)法滿足工作需要。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法具有快速簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、自動(dòng)化程度高的顯著特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[17-20],但未見有流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法分析食品中鹽酸二氟沙星的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立一種快速測(cè)定鹽酸二氟沙星的新方法,可用于動(dòng)物肝臟中微量鹽酸二氟沙星的測(cè)定。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        雞肝、豬肝 市售。

        鹽酸二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%) 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;的魯米諾(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%) 蘇州工業(yè)園區(qū)亞科化學(xué)試劑有限公司;過(guò)氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%) 煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為石英亞沸二次重蒸水。

        0.20mg/mL鹽酸二氟沙星儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.0050g鹽酸二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品,用重蒸水溶解后定容于25mL棕色容量瓶,4℃冰箱中保存,使用時(shí)用重蒸水逐級(jí)稀釋至所需濃度;1.0×10-2mol/L魯米諾貯備液:準(zhǔn)確稱取魯米諾0.4425g用0.10mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定容于250mL棕色容量瓶中,混勻避光保存兩周后使用,并逐級(jí)稀釋到所需濃度;0.20mol/L過(guò)氧化氫溶液:準(zhǔn)確吸取30%過(guò)氧化氫溶液5.10mL,用重蒸水定容于250mL棕色容量瓶中,混勻、備用,過(guò)氧化氫溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用;0.10mol/L磷酸鹽緩沖溶液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水溶解并定容于500mL。

        1.2 儀器與設(shè)備

        IFFM-D型流動(dòng)注射生物發(fā)光分析儀 西安瑞邁電子科技有限公司;固相萃取裝置(配C8柱) 美國(guó)Agilent公司;SKF-12超聲波清洗器(額定功率500W) 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;FA2004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence analysis

        用0.20mg/mL鹽酸二氟沙星儲(chǔ)備液配制成1.00×10-4mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,依次配制1.00×10-5、1.00×10-6、1.00×10-7、1.00×10-8、1.00×10-9mg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,備用。同時(shí)配制空白溶液,按儀器工作參數(shù)測(cè)定,待儀器基線穩(wěn)定后,注入標(biāo)準(zhǔn)溶液,記錄其發(fā)光強(qiáng)度(I標(biāo)),設(shè)空白的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為(I0),以鹽酸二氟沙星質(zhì)量濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以ΔI=I0-I標(biāo)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光反應(yīng)裝置見圖1。

        1.3.2 樣品的測(cè)定

        樣品用醫(yī)用剪刀剪成塊,勻漿,準(zhǔn)確稱取2.0000g于離心管中,準(zhǔn)確加磷酸鹽緩沖液10.00mL,在額定功率為500W超聲波清洗器中超聲5min后,12000r/min離心10min,取樣品上清液過(guò)固相萃取柱。

        固相萃取柱先用甲醇、磷酸鹽緩沖液各2.00mL依次預(yù)洗。準(zhǔn)確取樣品上清液2.00mL注入,用體積比1:19的甲醇-磷酸鹽混合液4.00mL,以10~15滴/min流速淋洗。棄去淋洗液后,用體積比1:19的氨水-甲醇混合溶液4.00mL,以10~15滴/min流速洗脫,定量收集洗脫液,于60~70℃氮?dú)庀麓蹈?,加少量重蒸水溶解并定容?0mL棕色容量瓶中,同時(shí)處理和配制樣品空白溶液,待測(cè)定。

        在與標(biāo)準(zhǔn)曲線完全相同的條件下測(cè)定空白溶液和樣品定容液的發(fā)光強(qiáng)度之差ΔIx=I0-I樣,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,求出樣品定容液中鹽酸二氟沙星的質(zhì)量濃度(ρ),按下式計(jì)算樣品中鹽酸二氟沙星的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ω)。

        式中:m為稱取樣品的質(zhì)量/g;ρ為鹽酸二氟沙星的質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 測(cè)定條件的選擇

        2.1.1 化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)的設(shè)定

        光電倍增管負(fù)高壓為450V、儀器增益為1時(shí),對(duì)化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明儀器在表1參數(shù)下運(yùn)行,發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定,且具有較大的信噪比。

        表1 化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)的設(shè)定Table 1 Working parameters of chemiluminescence instrument

        2.1.2 反應(yīng)介質(zhì)及其濃度的選擇

        當(dāng)魯米諾濃度6.0×10-4mol/L,過(guò)氧化氫濃度0.050mol/L時(shí),分別以0.10mol/L NaOH、Na2CO3、NaHCO3溶液為反應(yīng)介質(zhì),按2.1.1節(jié)儀器工作參數(shù),測(cè)定不同堿性介質(zhì)對(duì)魯米諾-過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的影響。實(shí)驗(yàn)表明:反應(yīng)介質(zhì)為氫氧化鈉時(shí),體系產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較為理想。相同條件下,考察0.050~0.35mol/L氫氧化鈉溶液對(duì)化學(xué)發(fā)光體系的影響,結(jié)果如圖2所示。

        圖2 氫氧化鈉濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of sodium hydroxide concentration on relative luminescence intensity

        由圖2可知,氫氧化鈉濃度為0.10mol/L時(shí),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大,選擇0.10mol/L氫氧化鈉為反應(yīng)介質(zhì)。

        2.1.3 魯米諾濃度的選擇

        氫氧化鈉濃度為0.10mol/L、過(guò)氧化氫濃度為0.050mol/L,按2.1.1節(jié)儀器工作參數(shù)運(yùn)行,考察魯米諾在1.0×10-4~1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,見圖3。

        圖3 魯米諾濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

        圖3表明:當(dāng)魯米諾濃度大于6.0×10-4mol/L,體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較大且基本保持穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)選取魯米諾濃度為7.0×10-4mol/L。

        2.1.4 試劑混合方法和放置時(shí)間的影響

        考察魯米諾與氫氧化鈉混合溶液、過(guò)氧化氫與氫氧化鈉混合溶液兩種不同混合方法對(duì)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。在相同條件下測(cè)定,結(jié)果表明過(guò)氧化氫與氫氧化鈉混合溶液對(duì)同濃度魯米諾溶液的相對(duì)化學(xué)發(fā)光值較大且穩(wěn)定。

        當(dāng)混合液中氫氧化鈉濃度0.10mol/L,過(guò)氧化氫濃度0.050mol/L時(shí),在魯米諾濃度7.0×10-4mol/L條件下,按2.1.1節(jié)儀器工作參數(shù)運(yùn)行,考察混合溶液混合放置5~25min時(shí),放置時(shí)間對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,結(jié)果表明:混合時(shí)間為12min時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定。

        2.1.5 過(guò)氧化氫濃度的選擇

        氫氧化鈉濃度為0.10mol/L、魯米諾濃度為7.0×10-4mol/L,混合12min,按2.1.1節(jié)儀器工作參數(shù)實(shí)驗(yàn),考察過(guò)氧化氫濃度在0.01~0.30mol/L范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,見圖4。

        圖4 過(guò)氧化氫濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxide concentration on relative luminescence intensity

        圖4表明:過(guò)氧化氫濃度為0.15~0.30mol/L時(shí),體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較大且基本穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)選擇過(guò)氧化氫濃度為0.20mol/L。

        2.2 洗脫液用量的確定

        按照1.3.2節(jié)中固相萃取柱的操作方法,用體積比1:19的氨水-甲醇混合溶液4.00mL,以10~15滴/min流速洗脫,定量收集洗脫液后,另取3.00mL相同的氨水+甲醇混合溶液再繼續(xù)洗脫時(shí)沒有測(cè)定信號(hào),表明用4.00mL洗脫液即可以洗脫完全。

        2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

        在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)1.00×10-7mg/mL鹽酸二氟沙星進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),在相對(duì)誤差±5%范圍內(nèi),100倍K+、Na+、Mg2+、SO42-、Cl-;50 倍 Ca2+、Fe2+、NO3-均不產(chǎn)生干擾。

        2.4 相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

        優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,按1.3.1節(jié)方法以鹽酸二氟沙星質(zhì)量濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值ΔI=I0-I標(biāo)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,鹽酸二氟沙星質(zhì)量濃度在1.00×10-5~1.00×10-9mg/mL實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),質(zhì)量濃度的負(fù)對(duì)數(shù)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有良好線性關(guān)系,線性方程為y=-24.4x+245.3,相關(guān)系數(shù)r為0.9956。對(duì)空白溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定的檢出限(RSN=3)為4.07×10-9mg/mL,平行測(cè)定的RSD為0.93%,定量限(RSN=10)為1.36×10-8mg/mL。

        2.5 測(cè)定結(jié)果及回收率

        在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,樣品按1.3.2節(jié)處理后上機(jī)測(cè)定,于5min內(nèi)可完成分析,測(cè)定結(jié)果以平均值報(bào)告,同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。

        表2 樣品測(cè)定結(jié)果及回收率Table 2 Recovery rates of difloxacin hydrochloride from spiked positive pork and chicken liver samples

        由表2可知,豬肝和雞肝樣品均未檢出鹽酸二氟沙星,加標(biāo)回收率分別為59.00%~78.63%和52.50%~72.63%。標(biāo)準(zhǔn)加入量為同一個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí),化學(xué)發(fā)光法與液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定氟喹諾酮類藥物的加標(biāo)回收率51.4%~72.5%相一致[21]。

        3 結(jié) 論

        在氫氧化鈉堿性介質(zhì)中,過(guò)氧化氫氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,微量鹽酸二氟沙星能有效抑制相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。通過(guò)對(duì)測(cè)定條件的優(yōu)化,建立了魯米諾-過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定動(dòng)物組織中鹽酸二氟沙星的新型分析方法,用于測(cè)定豬肝中鹽酸二氟沙星的加標(biāo)回收率達(dá)78.63%,測(cè)定雞肝中鹽酸二氟沙星的加標(biāo)回收率達(dá)72.63%,檢出限為4.07×10-9mg/mL,定量限為1.36×10-8mg/mL,該法儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本低廉,具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、成本低廉的顯著優(yōu)點(diǎn),有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

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        Determination of Difloxacin Hydrochloride Residue in Animal Liver by Solid Phase Extraction and Flow Injection Chemiluminescence

        ZHU Ying-rui,GAO Xiang-yang*,ZHAO Chen
        (College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

        A new quick method for the determination of difloxacin hydrochloride residue in pork and chicken livers using solid phase extraction followed by flow injection chemiluminescence analysis was presented based on the inhibition of chemiluminescence generation from the reaction between luminol and hydrogen peroxide by difloxacin hydrochloride. The results showed that an excellent linear relationship between chemiluminescence intensity and negative logarithm of difloxacin hydrochloride concentration was observed in the range of 1.00 × 10-5-1.00×10-9mg/mL. The limit of detection for difloxacin hydrochloride was 4.07 × 10-9mg/mL. The precision was 0.93% (relative standard deviation, RSD) for eleven replicate determinations. Therefore,this method can be used for the determination of difloxacin hydrochloride in animal liver with satisfactory results.

        difloxacin hydrochloride;flow injection chemiluminescence;animal liver;solid phase extraction

        O657.3;R917

        A

        1002-6630(2012)16-0184-04

        2012-02-20

        河南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)基金項(xiàng)目(10466-X-082301)

        朱盈蕊(1986—),女,碩士研究生,主要從事食品安全、現(xiàn)代食品分析技術(shù)研究。E-mail:zhuyanan521 @163.com

        *通信作者:高向陽(yáng)(1949—),男,教授,主要從事食品分析、食品資源開發(fā)研究。E-mail:ndgaoxy@163.com

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