李立順，時(shí)維靜*，馬迅兵

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

北五味子種子和果肉中的活性成分比較

李立順，時(shí)維靜*，馬迅兵

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

目的：比較北五味子種子和果肉中活性成分的差異。方法：采用薄層色譜法比較北五味子種子、果肉和果實(shí)中木脂素成分含量；采用苯酚-硫酸法測(cè)定種子、果肉和果實(shí)及果肉不同組分糖的含量；薄層色譜法分析三氟乙酸水解后，果肉不同組分單糖組成。結(jié)果：北五味子木脂素類主要在種子中；北五味子在果肉和種子中的總糖含量分別為169.34、5.366mg/g；果肉中各組分糖含量分別為醇溶組分117.06mg/g、醇沉組分75.67mg/g、多糖組分12.37mg/g。三氟乙酸水解后薄層分析，醇溶組分主要由葡萄糖組成，多糖組分主要由葡萄糖、半乳糖組成。結(jié)論：北五味子種子和果肉中活性成分存在明顯差異。

北五味子；種子；果肉；木脂素；多糖

北五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于遼寧、黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等地。五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為名貴中藥具有悠久的歷史，不僅有良好的醫(yī)療保健作用，也是國(guó)家衛(wèi)生部公布的藥食同源品之一。

現(xiàn)代藥理研究表明，五味子有保肝益腎、保護(hù)心腦血管、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和免疫增強(qiáng)作用[1]。五味子主要含木脂素(8%)[2]、多糖(11.98%)[3]、揮發(fā)油、三萜、有機(jī)酸、氨基酸和無(wú)機(jī)元素等?！吨袊?guó)藥典》(2010年版)規(guī)定，五味子藥材中含五味子醇甲不得少于0.40%[4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)五味子的活性成分研究多集中在木脂素和多糖[5-8]。本實(shí)驗(yàn)比較北五味子果實(shí)，種子和果肉中活性成分的差異，為更好地利用五味子開發(fā)保健食品提供參考，也為臨床用藥、炮制和生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 藥材與試劑

北五味子(產(chǎn)地：遼寧)購(gòu)于安徽省亳州市。經(jīng)安徽科技學(xué)院食品藥品分析檢測(cè)中心時(shí)維靜教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)。

對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。五味子甲素(批號(hào)：110764-200408)、五味子乙素(批號(hào)：110765-20050)、五味子醇甲(批號(hào)：110857-200709)、鼠李糖(批號(hào)：111683-200401)；D-阿拉伯糖(批號(hào)：111506-200001)；蔗糖(批號(hào)：111507-200001)；D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)：110833-200904)；乳糖(批號(hào)：111646-200301)；半乳糖(批號(hào)：100226-200404)；D-木糖(批號(hào)：111508-200404)；高效硅膠G、GF254薄層板(規(guī)格：20cm×10cm，批號(hào)：20090724) 青島海洋化工廠；超純水；三氟乙酸、重蒸酚等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CAMAG TLC SCANNER 3薄層掃描儀、LINOMAT 5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、TCL VISALIZER薄層色譜成像文件系統(tǒng) 瑞士Camag公司；CP225D準(zhǔn)微量天平 德國(guó)賽多利斯公司；TU-1810SPC紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)及果肉和種子的分離制備

取北五味子果實(shí)500g，50℃干燥12h，置干燥器中放涼。精密稱取100.00g三份，分別加水潤(rùn)透，分離果肉與種子，再置干燥箱中50℃干燥，放涼，稱量，記錄。

1.2.2 種子、果肉和果實(shí)中木脂素類測(cè)定

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取北五味子甲素，五味子乙素，五味子醇甲對(duì)照品：2.0、1.8、3.0mg分別置2mL容量瓶中，加二氯甲烷溶解定容，搖勻，即得。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取五味子種子、果肉和果實(shí)粉末1.00g，分別置具塞三角燒瓶中，加二氯甲烷20mL，超聲提取(功率250W，頻率35kHz)30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄槿芙?，定容?mL作為供試品液。

1.2.2.3 薄層色譜條件與檢測(cè)

取20cm×10cm硅膠GF254高效薄層板，110℃活化30min；采用半自動(dòng)點(diǎn)樣儀噴霧點(diǎn)樣，帶寬6.00mm；底邊高度10mm；點(diǎn)樣量：供試品溶液，果肉4μL、種子2μL、果實(shí)2μL，均為2個(gè)重復(fù)；對(duì)照品溶液分為高濃度(S1)和低濃度(S2)分別點(diǎn)于同一軌道，五味子乙素5、1μL；五味子甲素3、0.5μL；五味子醇甲4、1μL，3個(gè)重復(fù)。樣品和對(duì)照品共12個(gè)軌道在同一薄層板上。以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1，V/V)為展開劑，于雙槽展開缸預(yù)飽和20min，薄層板平衡20min，上行展開展距8cm。室溫18℃，相對(duì)濕度約55%。

展開后，揮干溶劑，于薄層色譜成像系統(tǒng)254nm波長(zhǎng)處拍攝熒光薄層色譜圖。

使用薄層掃描儀，單波長(zhǎng)反射直線掃描法，λ＝254nm，狹縫4.00mm×0.30mm，掃描速率20mm/s獲得掃描光譜圖。采用外標(biāo)兩點(diǎn)法，進(jìn)行線性回歸。

對(duì)薄層板的同一斑點(diǎn)每間隔1～2h掃描測(cè)定一次，考查12h內(nèi)的穩(wěn)定性。精密吸取對(duì)照液各2μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上，共5個(gè)點(diǎn)，依法展開、掃描測(cè)定，進(jìn)行精密度考查。采用樣品與對(duì)照品同板點(diǎn)樣、展開、掃描，外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)定，線性回歸方程計(jì)算含量。

1.2.3 北五味子種子、果肉和果實(shí)總糖檢測(cè)

1.2.3.1 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的北五味子果肉、種子和果實(shí)粉末各2.0g, 置于索氏提取器中，加入石油醚(60～90℃)水浴回流提取3次，每次1h，棄提取液。將藥粉揮干溶媒后，置于圓底燒瓶中，加蒸餾水100mL，加熱回流提取3次，每次1h，合并濾液，水浴濃縮后，定容至250mL，備用。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備

精密稱定1 0 5℃干燥至質(zhì)量恒定的無(wú)水葡萄糖10mg，定容于10mL容量瓶中，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1g/L的儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中分別精密移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于6個(gè)10mL容量瓶中，定容，配制成10、20、40、60、80、100mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各1.0mL，空白取1.0mL水，分別置于10mL試管中，各加5%重蒸酚1.0mL后充分振搖，在迅速加入濃硫酸5.0mL，振搖，室溫放置30min后，于488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為A＝0.00787C＋0.00485(R2＝0.9995)。結(jié)果表明，葡萄糖在 10～100mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.2.4 果肉不同組分糖的測(cè)定及酸水解

1.2.4.1 果肉不同組分制備

精密稱取干燥果肉粉末2.00g，按1.2.3.1節(jié)的方法提取，將濾液用活性炭除色后濃縮，加乙醇，使含乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，4℃放置24h，4800r/min、20min離心分離，得醇沉組分(粗多糖)和醇溶組分(單糖、低聚糖等)，80℃真空干燥48h，計(jì)算得膏率。另取干燥果肉粉末5.00g，按上法制得果肉粗多糖，用少量蒸餾水稀釋，Sevag法反復(fù)多次脫蛋白，再用氯仿、丙酮、無(wú)水乙醇依次洗滌多次，干燥，得精制多糖粉末，稱量，計(jì)算得率。

1.2.4.2 對(duì)照品溶液制備

分別稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖對(duì)照品1.5、1.2、1.8、0.8、1.1、0.9、2.0mg，分別用超純水定容于1mL容量瓶中，得糖對(duì)照品溶液。

1.2.4.3 供試品溶液制備

稱取精制多糖24.20mg，醇溶組分34.20mg，置安培瓶中，分別加入2mL 2mol/L三氟乙酸溶液，封口后于110℃水解4h，冷卻后，過濾除去不溶物，用N2除去多余的三氟乙酸。分別用蒸餾水定容至10mL容量瓶，備用。

1.2.4.4 薄層色譜條件

取高效硅膠G板，110℃活化30min，半自動(dòng)點(diǎn)樣儀噴霧點(diǎn)樣，帶寬6.00mm；底邊高度10mm；對(duì)照品與供試品同板點(diǎn)樣各2μL，以正丁醇-乙酸乙酯-異丙醇-醋酸-水-吡啶(7:20:12:7:6:6，V/V)為展開劑，上行展開8cm，取出，晾干。噴苯胺-二苯胺溶液顯色劑，110℃烘至斑點(diǎn)清晰。于薄層色譜成像系統(tǒng)白光下拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子果肉和種子占果實(shí)的比率

將果實(shí)分離的果肉與種子，精密稱量，計(jì)算出果肉和種子占果實(shí)的百分比，結(jié)果見表1。

表1 北五味子果實(shí)中種子和果肉含量Table 1 Percentages of seed and flesh in Schisandrae chinensis Fructus

2.2 果實(shí)、種子和果肉中木脂素類成分的比較

2.2.1 薄層色譜定性比較

按1.2.4.4節(jié)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由254nm波長(zhǎng)處拍攝的熒光薄層色譜圖(圖1)可以看出，樣品分離良好，對(duì)照品從上至下依次為五味子乙素、五味子甲素、五味子醇甲。從相對(duì)應(yīng)的色譜條帶，可清晰對(duì)比出同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)下種子的3種成分高于果實(shí)；果肉雖加倍點(diǎn)樣量，也極微量。表明五味子木脂素類成分主要存在種子中。

圖1 北五味子果肉、種子、果實(shí)及對(duì)照品的薄層色譜圖Fig.1 HPTLC profile of mixed deoxyschizandrin, γ-schizandrin and schisandrin standards and Soxhlet extracts from fresh, seed and whole fruit of Schisandrae chinensis Fructus

2.2.2 薄層掃描含量測(cè)定

按1.2.4.4節(jié)的方法，樣品與對(duì)照品同板點(diǎn)樣、展開、掃描、測(cè)定。穩(wěn)定性考查結(jié)果顯示，斑點(diǎn)在12h內(nèi)穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%(n＝5)。精密度考查對(duì)照液5個(gè)點(diǎn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9(n＝5)。采用外標(biāo)兩點(diǎn)法，得回歸方程為：Y乙素＝2923.660＋3.101X(r＝0.99970，s＝1.76%)；Y甲素＝2313.764＋4.365X(r＝0.99942，s＝2.65%)；Y醇甲＝8249.184＋1940.532X(r＝0.99932，s＝1.47%)。乙素、甲素、醇甲分別在0.9～4.5、0.5～3.0、1.5～6.0μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。五味子果實(shí)、種子和果肉薄層掃描色譜峰圖(圖1)和三維圖(圖2)可比較3者的差異，果實(shí)、種子和果肉中五味子甲素、乙素、醇甲的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

圖2 五味子果實(shí)、種子和果肉薄層掃描三維圖譜Fig.2 Three-dimension (3D) TLC of Soxhlet extracts from fresh, seed and whole fruit of Schisandrae chinensis Fructus

表2 果實(shí)、種子和果肉中五味子甲素、乙素、醇甲的含量Table 2 Contents of deoxyschizandrin,γ-schizandrin and schisandrin in whole fruit, seed and flesh of Schisandrae chinensis Fructus

2.3 種子、果肉和果實(shí)中總糖含量比較

光譜掃描結(jié)果在488nm波長(zhǎng)處有最大吸收(圖3)。取果肉、種子和果實(shí)供試品溶液1mL分別定容于25mL量瓶中，精密移取1.0mL，按1.2.3.3節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算總糖含量(表3)。結(jié)果表明，果肉的總糖含量是種子的3倍。

圖3 紫外-可見分光光度計(jì)光譜掃描結(jié)果Fig.3 Visible absorption spectrum of Schisandrae chinensis Fructus extract

表3 果肉、種子和果實(shí)中總糖的含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Total sugar contents in fresh, seed and whole fruit of Schisandrae chinensis Fructus

2.4 果肉中不同組分糖含量比較

精密稱定醇溶組分、醇沉組分和多糖組分各1.0mg，定容25mL量瓶中，配制成40mg/L待測(cè)溶液。照1.2.3.3節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光度，結(jié)合得膏率，計(jì)算每克果肉各組分糖的含量，結(jié)果見表4。

表4 果肉不同組分糖的含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Polysaccharide contents in different fractions from Schisandrae chinensis Fructus flesh

2.5 果肉各組分單糖組成分析

圖4 五味子果肉的糖水解物及標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖Fig.4 HPTLC profile of sugar standards, hydrolyzed alcohol-soluble fraction and hydrolyzed purified polysaccharide fraction from Schisandrae chinensis Fructus flesh

將五味子果肉醇溶組分(A)、精制后多糖(B)酸水解后，與葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖對(duì)照品，同板點(diǎn)樣，分析其單糖組成(圖4)。結(jié)果表明，果肉醇溶組分主要是葡萄糖(S1)，多糖組分主要是葡萄糖(S1)和半乳糖(S7)。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，北五味子木脂素類成分主要在其種子中，糖類成分主要在其果肉中。將果肉提取物分為醇沉組分(粗多糖等)、醇溶組分(單糖、低聚糖等)及精制多糖，果肉中單糖、低聚糖的含量高于多糖。采用三氟乙酸水解處理發(fā)現(xiàn)，果肉中醇溶組分主要是葡萄糖，果肉中多糖組成主要是葡萄糖和半乳糖。提示開發(fā)利用五味子的不同成分，選用不同的藥用部位，可提高利用率，減少浪費(fèi)[9]。

高效薄層色譜法能同時(shí)完成多個(gè)樣品的薄層色譜圖比較，尤其適用于藥材、食品中復(fù)雜天然產(chǎn)物的組分分離及定性、定量分析[10]。通過色譜圖譜可直觀將各樣品的相似程度和差異展示在同一張圖像中，從圖1、2和表2可以比較出五味子木脂素類成分主要在種子。圖4的單糖組成比較，果肉醇溶組分主要是葡萄糖；多糖組分主要是葡萄糖和半乳糖。本實(shí)驗(yàn)選用的北五味子采用藥典中的高效液相色譜法檢測(cè)五味子醇甲含量為1.47%[11]，因提取和檢測(cè)方法不同，結(jié)果有一定差別。

本實(shí)驗(yàn)采用Sevag法除蛋白和2mol/L三氟乙酸水解，李巧云等[12]認(rèn)為，酶法與Sevag聯(lián)用法用于五味子粗多糖脫蛋白效果很好。孟憲軍等[13]在五味子多糖的分離純化中，采用酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合脫蛋白。孫元琳等[14]報(bào)道不同程度酸水解和酶水解所得水解產(chǎn)物不一樣。

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Comparative Analysis of Bioactive Component in Seeds and Flesh ofSchisandrae chinensisFructusby Thin Layer Chromatography

LI Li-shun，SHI Wei-jing*，MA Xun-bing
(School of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective: To comparatively analyze bioactive components in seeds and flesh ofSchisandrae chinensisFructus.Methods: The contents of lignan in seeds, flesh and whole fruit ofSchisandrae chinensis Fructuswere determined by high performance thin layer chromatography (HPTLC). Sulfuric acid-phenol method was used to quantify sugar. After trifluoroacetic acid hydrolysis, the monosaccharide composition of the flesh was analyzed by HPTLC. Results: Lignans inSchisandrae chinensis Fructuswere mainly present in the seeds, and total sugar content was 169.34 mg/g in the flesh and 5.366 mg/g in the seeds. The alcoholsoluble, alcohol-insoluble and polysaccharide components were 117.06, 75.67 mg/g and 12.37 mg/g in the fresh, respectively. The alcohol-soluble fraction was mainly composed of glucose. The polysaccharide fraction was mainly composed of glucose and galactose.Conclusion: Bioactive components reveal a significant difference between seeds and flesh ofSchisandrae chinensis Fructus.

Schisandrae chinensisFructus；seeds；flesh；lignanoid；polysaccharides

R284.2；R931.6

A

1002-6630(2012)16-0175-04

2011-07-28

安徽省科技廳科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(07010300153)；安徽省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心基金項(xiàng)目(ZYC20101503)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(ZRC2011294)

李立順(1957—)，男，副教授，主要從事中藥活性成分及復(fù)方應(yīng)用研究。E-mail：lls3212@163.com

*通信作者：時(shí)維靜(1957—)，女，教授，主要從事中藥活性成分分離與檢測(cè)研究。E-mail：shiwj80@yahoo.com.cn