張金連，張翠平，鄭火青，易松強，胡福良

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

基于β-葡萄糖苷酶活力的蜂蜜真?zhèn)舞b別

張金連，張翠平，鄭火青，易松強，胡福良

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

提出以β-葡萄糖苷酶活力為指標(biāo)的蜂蜜真?zhèn)舞b別新方法，采用分光光度法分析不同來源蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶活力，研究不同儲存條件下蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力的變化規(guī)律，探討摻入不同比例大米高果糖漿的蜂蜜中以β-葡萄糖苷酶活力的變化規(guī)律。結(jié)果表明：不同來源蜂蜜中均能檢測出β-葡萄糖苷酶活力，而大米高果糖漿中檢測不到該酶活力；不同濃度油菜蜜分別在－18、4、25(室溫)、30℃條件下儲存11個月，隨著儲存時間的延長，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力變化較小；隨著油菜蜜中大米高果糖漿的摻假比例增大，β-葡萄糖苷酶活力呈線性下降。因此，β-葡萄糖苷酶活力是檢測蜂蜜是否摻假的一個有效定性指標(biāo)。

蜂蜜；β-葡萄糖苷酶；真?zhèn)?；鑒別

蜂蜜是一種天然產(chǎn)品，具有較高的藥用價值和保健功效[1-2]，一直深受消費者青睞。蜂蜜摻雜使假現(xiàn)象由來已久，嚴(yán)重影響了蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展、出口創(chuàng)匯以及消費者的權(quán)益。近年來，蜂蜜摻假發(fā)展為摻入葡萄糖、葡萄糖漿、果葡糖漿等[3-7]物質(zhì)，這些摻假的蜂蜜感官指標(biāo)和部分理化指標(biāo)與天然蜂蜜極為相似。用穩(wěn)定性碳同位素方法雖可以解決玉米高果糖漿等來源于C4植物糖漿的摻假問題[8]，但是，由于水稻與蜜源植物均為C3植物，而來源于水稻的大米高果糖漿中同位素成分與天然蜂蜜極為相似，目前用此方法較難鑒別出天然蜂蜜中是否摻入大米高果糖漿。因此，亟需建立一套行之有效的方法鑒別蜂蜜和大米高果糖漿。

蜂蜜是動植物雙源性產(chǎn)品，蜜蜂在釀制蜂蜜時加入了多種酶類[9-12]。Low等[13]首次在蜂蜜中檢測到β-葡萄糖苷酶活力；Pontoh等[14]從意大利蜜蜂的咽下腺、胃和蜜囊中分離純化出β-葡萄糖苷酶，而且這3個組織中的β-葡萄糖苷酶是相同的。因此，他們推斷β-葡萄糖苷酶是由工蜂的咽下腺產(chǎn)生，分泌到嘴里，通過飼喂到達蜜囊，然后從蜜囊轉(zhuǎn)移到巢脾；易松強等[15]研究發(fā)現(xiàn)，蜂蜜中均能檢測到β-葡萄糖苷酶活力，而在花蜜中檢測不到該酶活力，初步證實蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶來源于蜜蜂。

本實驗采用分光光度法檢測不同來源和種類蜂蜜以及市售大米高果糖漿中的β-葡萄糖苷酶活力，比較不同儲存時間和溫度下，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力的穩(wěn)定性和摻入不同比例大米高果糖漿的蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力的變化規(guī)律，為蜂蜜的真?zhèn)舞b別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5種天然蜂蜜從蜂場直接獲得；12種國內(nèi)產(chǎn)‘雜花蜜’、‘棗花蜜’、‘椴樹蜜’、‘龍眼蜜’、‘荔枝蜜’、‘柑橘蜜’、‘黃芪蜜’、‘黨參蜜’、‘六道木蜜’、‘龍眼蜜’和4種國外產(chǎn)的‘赤桉樹蜜’、‘黃桉樹蜜’、‘薰衣草蜜’、‘松樹蜜’蜂蜜；大米糖漿 市購。

對-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG) 北京凱森醫(yī)藥科技有限公司；其他均為分析純。

UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶活力的測定

[13]，采用p-NPG法進行β-葡萄糖苷酶活力測定。稱取1.00g蜂蜜樣本，用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0)定容至10mL容量瓶作為粗酶液。吸取1.0mL粗酶液和1.0mL 30mmol/L對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(p-NPG)于試管中，混勻后置于37℃水浴中加熱1.5h。在水浴中加熱后的反應(yīng)混合液中立即加入5.0mL 1mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫后，在波長400nm處測定吸光度。另外，取1.0mL粗酶液和1.0mL 30mmol/Lp-NPG于試管中，立即置于沸水浴中加熱5min滅活后，加入5.0mL 1mol/L Na2CO3溶液，作為空白對照。

每分鐘催化形成1μmol對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力為每克蜂蜜具有的酶活力單位數(shù)。

1.2.2 樣品處理

將新鮮的不同波美度(37、39、41°Be)的油菜蜜分裝在若干個潔凈的瓶子中，密封后分別置于－18、4、25(室溫)、30℃冷柜或培養(yǎng)箱中儲存，然后每月按照上述方法測定樣品的β-葡萄糖苷酶活力。

將新鮮的不同波美度(37、39、41°Be)的油菜蜜中分別摻入10%、20%、30%、40%、50%的大米高果糖漿，然后按照上述方法測定樣品的β-葡萄糖苷酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力

由表1可見，從蜂場取得的5種天然蜂蜜中均檢測到β-葡萄糖苷酶活力，其酶活力范圍為14.78～33.91mU/g。不同植物來源蜂蜜的β-葡萄糖苷酶活力變化較大，最高的紅豆草蜜是最低的洋槐蜜酶活力的2倍多。

表1 天然蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果Table 1 β-glucosidase activity in natural honey samples

表2 國內(nèi)市售蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果Table 2 β-glucosidase activity in commercial honey samples in China

由表2可見，不同種類的國內(nèi)市售天然蜂蜜中均檢測到β-葡萄糖苷酶活力。酶活力高低依植物來源不同差異大，范圍為7.70～40.77mU/g。β-葡萄糖苷酶活力最高的棗花蜜酶活力為最低的2號雜花蜜的5倍多。

表3 國外市售蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果Table 3 β-glucosidase activity in commercial honey samples outside of China

由表3可知，不同植物來源、不同地理來源的國外市售天然蜂蜜均檢測到β-葡萄糖苷酶活力，酶活力范圍為12.52～19.16mU/g。不同來源的天然蜂蜜中亦均可檢測到β-葡萄糖苷酶活力，但該酶活力依植物來源不同變化很大。

2.2 不同儲存條件對蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力的影響

隨儲存溫度、時間不同，37°Be油菜蜜中β-葡萄糖苷酶活力變化趨勢不同。由圖1A可知，在低溫(－18℃)條件下，隨著時間的延長，油菜蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力無顯著變化。當(dāng)儲存溫度為4℃時，隨著時間的延長，油菜蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力呈線性下降，其線性曲線方程為y＝－0.1161x＋7.8844(R2＝0.9206)，損失率為13.75%。當(dāng)儲存在室溫和30℃時，37°Be油菜蜂蜜的β-葡萄糖苷酶活力隨著時間的延長先增大后減小，在5個月時達到極大值，儲存至11個月時酶活力損失率分別為12.03%和9.67%。這表明，37°Be油菜蜂蜜在不同溫度下儲存11個月，其酶活力變化較小，說明蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶較穩(wěn)定。

圖1 不同儲存條件對37(A)、39°Be(B)和41°Be(C)油菜蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.1 Effect of storage condition on β-glucosidase activity in rape honey with different Baume degrees

由圖1B可知，39°Be油菜蜜在不同溫度下儲存不同時間，其β-葡萄糖苷酶活力的變化與37°Be的油菜蜜相似：在－18℃條件下，39°Be油菜蜜隨儲存時間延長，酶活力差異不顯著；在4℃條件下儲存11個月，其酶活力損失率為17.95%；在室溫和30℃條件下儲存，損失率分別為10.81%和11.14%。

由圖1C可知，與37、39°Be油菜蜜不同，41°Be油菜蜜除在－18℃條件下儲存不同時間，其酶活力變化不顯著外，隨著儲存溫度(4℃、室溫、30℃)的升高、儲存時間的延長，樣品中β-葡萄糖苷酶活力逐漸下降，且趨勢相同，儲存至11個月時酶活力損失率分別為35.69%、39.40%和39.67%。

從圖1可見，油菜蜜中β-葡萄糖苷酶活力隨油菜蜜成熟度的升高，其酶活力增加；不同成熟度的油菜蜜在－18℃條件下儲存不同時間β-葡萄糖苷酶活力均沒有顯著變化；在4℃儲存時，均呈線性下降；而在室溫或30℃儲存時，低成熟度油菜蜜(37、39°Be)隨時間延長，其β-葡萄糖苷酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而41°Be的油菜蜜呈線性下降。

2.3 不同來源的大米高果糖漿中β-葡萄糖苷酶活力

表4 大米糖漿中的β-葡萄糖苷酶活力Table 4 β-glucosidase activity in high-fructose rice syrup

由表4可知，采用分光光度法檢測大米高果糖漿的β-葡萄糖苷酶活力，其吸光度均小于0.02mU/g對應(yīng)吸光度，而分光光度計的準(zhǔn)確測量范圍為 0.100～0.900，因此，可認(rèn)為大米高果糖漿中未檢測到β-葡萄糖苷酶活力。

2.4 摻入不同比例大米高果糖漿的蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力

隨著蜂蜜中摻入大米高果糖漿比例增大，37、39、41°Be的油菜蜜中β-葡萄糖苷酶活力均逐漸下降(圖2)，其線性方程分別為：y＝－14.737x＋15.563(R2＝0.9563)；y＝－28.868x＋27.48(R2＝0.9952)；y＝－21.557x＋21.787(R2＝0.9931)。結(jié)果表明，油菜蜜的真實性與所測得的酶活力呈正比：酶活力越高，含天然蜂蜜越多；酶活力越低，含天然蜂蜜越少。

圖2 不同波美度油菜蜜中摻入不同比例大米高果糖漿后的β-葡萄糖苷酶活力Fig.2 Effect of adulteration proportion of rice syrup onβ-glucosidase activity in rape honey with various Baume degrees

3 討 論

本研究在未經(jīng)過加工的天然蜂蜜和所有加工過市售天然蜂蜜中均檢測到β-葡萄糖苷酶活力，而在大米高果糖漿中均未檢測到該酶活力。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中，可來源于植物、微生物，也可來源于動物[16-18]。有研究表明，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶來源于蜜蜂[15]，而且Sanchez等[19]也在57種未經(jīng)加工的新鮮蜂蜜中檢測到β-葡萄糖苷酶活力。這說明，β-葡萄糖苷酶活力是鑒別天然蜂蜜和大米高果糖漿的有效指標(biāo)。但是，不同來源的天然蜂蜜其酶活力變化較大，而且β-葡萄糖苷酶是蜂蜜中含有而大米高果糖漿中不含有的，因此，以β-葡萄糖苷酶活力為指標(biāo)可定性區(qū)分天然蜂蜜與大米高果糖漿，而對天然蜂蜜中是否摻入大米高果糖漿則無能為力。因此，還需要擴大樣本量，根據(jù)蜂蜜的來源界定各種蜂蜜的β-葡萄糖苷酶活力范圍值，為蜂蜜摻假鑒別提供基礎(chǔ)。

在貯存溫度30℃、室溫條件下，37、39°Be蜂蜜酶活力先增大后減少，且在5個月時達到最大值，而4℃條件下的各波美度蜂蜜的酶活力呈現(xiàn)降低現(xiàn)象。Sanchez等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，蜂蜜中酶活力先增大后減小，且在6個月時，達到最大值(上升11.2%)，這與本實驗的研究結(jié)果基本一致。究其原因，可能是由于蜂蜜中存在部分的酵母菌等微生物[20]，酵母菌本身能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶[21-23]，在低濃度蜂蜜的溫度環(huán)境下適宜繁殖，因此酶活力會有一個上升的過程，但隨著儲存時間的增加，酵母菌的繁殖受到抑制或死亡，導(dǎo)致酶活力也逐漸下降。而高波美度(41°Be)的蜂蜜足以抑制酵母菌的繁殖活動，因此，隨儲存時間的延長酶活力逐漸下降。

不同來源的β-葡萄糖苷酶，其酶學(xué)性質(zhì)(蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)及組成)存在一定的差異。例如，羅水忠等[24]研究表明綠豆中含有兩種β-葡萄糖苷酶同功酶，兩種同功酶分別被純化了3.02倍和7.24倍，分子質(zhì)量分別為92.4kD和140.0kD，其中一種為雙亞基蛋白酶；Michlmayr等[25]從短乳桿菌中分離出的β-葡萄糖苷酶是一種同源四聚體，該分子質(zhì)量為330kD。因此若在蜂蜜中人為加入β-葡萄糖苷酶，則可以從該酶的生物化學(xué)特性等角度進行鑒別，但這方面還有待進一步研究。

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Discrimination between Authentic and Fake Honey Based onβ-Glucosidase Activity

ZHANG Jin-lian，ZHANG Cui-ping，ZHENG Huo-qing，YI Song-qiang，HU Fu-liang
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

A new method usingβ-glucosidase activity was proposed to detect honey adulteration. The activities ofβ-glucosidase in honey from different plants, different storage conditions, and different proportions of high-fructose rice syrup were determined. The results showed thatβ-glucosidase activity was detectable in honey samples from different plants; however,noβ-glucosidase activity was detected in honey adulterated with high-fructose rice syrup.β-glucosidase activity in rape honey showed little change during 11 months of storage at －18 ℃, 4 ℃, room temperature or 30 ℃. With increasing high-fructose rice syrup adulteration,β-glucosidase activity revealed a linear decline. In conclusion,β-glucosidase activity can be considered as an effective indicator for the identification of honey adulteration.

honey；β-glucosidase；adulteration；identification

TS201.25

A

1002-6630(2012)16-0150-04

2011-07-13

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂產(chǎn)業(yè))技術(shù)體系專項(CARS-45)

張金連(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為蜜蜂科學(xué)。E-mail：jinlianzhang@126.com

*通信作者：胡福良(1964—)，男，教授，博士，研究方向為蜜蜂科學(xué)。E-mail：flhu@zju.edu.cn