劉晶晶，趙泓筠，韓曜平，王雪鋒，戴陽(yáng)軍

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500)

響應(yīng)面法優(yōu)化菊花腦黃酮提取工藝

劉晶晶，趙泓筠，韓曜平，王雪鋒，戴陽(yáng)軍

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500)

采用Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法研究菊花腦黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，菊花腦黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、提取時(shí)間89min、水浴溫度68℃、液料比41:1(mL/g)，黃酮提取得率2.88mg/g。

菊花腦；黃酮；響應(yīng)面法；提取

菊花腦(Chrysanthemum nankingense)，菊科菊屬，多年生宿根性草本植物，為南京八野菜之一。嫩莖葉食用，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，具有濃郁的菊香味，食之清爽可口，色、香、味具佳。菊花腦可炒食、作湯或作火鍋料，具有清熱解毒、平肝明日、調(diào)中開(kāi)胃、降血壓等功效[1]。菊花腦含黃酮類、菊甙、腺嘌呤、膽堿、VB1、VC、低聚糖、茶多酚、天然抗氧化物質(zhì)、膳食纖維和多種風(fēng)味物質(zhì)(如葉綠素、花黃素、香精)及多種揮發(fā)油；還含有豐富的無(wú)機(jī)鹽，如Na、Ca、M g、Z n、C u、F e、M n、P 等[2]。

周麗娜等[3]對(duì)菊花腦莖葉甲醇提取物進(jìn)行特征測(cè)定，觀測(cè)到黃酮類化合物的特征吸收峰帶；并用高效液相色譜法分析測(cè)定菊花腦干品中總黃酮含量為0.203%，而菊花腦中黃酮類化合物提取工藝的優(yōu)化未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以菊花腦為原料，用乙醇來(lái)提取黃酮，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其菊花腦黃酮的提取工藝，為菊花腦黃酮提取的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

菊花腦 中澳合資亞寶食品有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH(均為分析純)。

FA2004型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；pHS-2F型pH計(jì) 上海精科儀器有限公司；DFT-200型高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；722s型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4-6]

精密稱取蘆丁標(biāo)品10.00mg，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液溶解定容至100mL，搖勻，即得到0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5mL于7只10mL帶刻度的試管中，各加30%乙醇溶液定容至5mL，加5% NaNO2溶液0.3mL，搖勻，放置6min；加10% Al(NO3)3溶液0.3mL，混勻放置6min，加4% NaOH溶液2mL搖勻，最后加30%乙醇溶液定容到10mL，混勻放置20min后在510nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可見(jiàn)蘆丁溶液在0.005～0.045mg/mL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系(R2＝0.9995)，吸光度(A)與蘆丁質(zhì)量濃度(C)之間的回歸方程式為：A＝6.4673C+0.0047

1.2.2 菊花腦黃酮提取與得率測(cè)定

取優(yōu)質(zhì)干燥的菊花腦，粉碎過(guò)篩，準(zhǔn)確稱取1.00g，加入乙醇在不同條件下回流提取，提取液減壓抽濾后，將濾液定容到一定體積。精確移取1mL濾液，按照

1.2.1節(jié)方法測(cè)定黃酮含量。計(jì)算黃酮提取得率。

式中：C為試樣的測(cè)定質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為濾液體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)[7-10]

在固定提取條件pH7、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、浸提時(shí)間1h、浸提溫度60℃、料液比1:40條件下，分別以pH值(5、6、7、8、9)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、45%、60%、75%、90%)、液料比(20:1、30:1、40:1、50:1、60:1(mL/g))、浸提時(shí)間(30、60、90、120、150、180min)、浸提溫度(40、50、60、70、80℃)五個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)黃酮提取得率的影響。

1.2.4 菊花腦黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)[11-15]

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 7.1.6軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度和液料比4個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以黃酮提取得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 菊花腦黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization variables used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響

圖1 pH值對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響Fig.1 Effect of pH on extraction rate of flavonoids from Chrysanthemum nankingense

由圖1可知，隨著pH值的增大，黃酮的提取得率先升高后降低，當(dāng)pH7時(shí)，菊花腦黃酮的提取得率最高，為2.95mg/g，可以看出菊花腦中黃酮提取適宜在中性的環(huán)境中進(jìn)行，選擇pH7較合適。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids from Chrysanthemum nankingense

由圖2可知，菊花腦中黃酮的提取得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)75%時(shí)，黃酮提取得率最高，繼續(xù)增大黃酮的提取得率反而下降，這是由于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，黃酮具有較高的極性，根據(jù)相似相溶原理，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)對(duì)菊花腦黃酮的溶解能力最強(qiáng)，所以選擇體積分?jǐn)?shù)75%比較合適。

2.3 料液比對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響

圖3 液料比對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of flavonoids from Chrysanthemum nankingense

由圖3可以看出，隨著提取溶劑體積的增大，提取得率也隨之增大。這是因?yàn)殡S著提取溶劑體積的增大，菊花腦粉末與提取溶劑接觸面的濃度差增大，黃酮就越容易滲透出來(lái)；當(dāng)提取溶劑體積增大到一定值后，由于菊花腦中黃酮的含量有限，提取得率的增加趨于平緩。而且，溶劑的用量增加，導(dǎo)致提取成本的增加，因此，確定液料比40:1。

2.4 提取時(shí)間對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids from Chrysanthemum nankingense

由圖4可以看出，在水浴加熱提取的前90min，提取時(shí)間越長(zhǎng)，黃酮提取得率越高。但提取時(shí)間超過(guò)90min后，提取得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)反而降低，這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致菊花腦中某些黃酮被破壞。因此水浴加熱提取的時(shí)間選擇在90min較好。

2.5 提取溫度對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響

圖5 提取溫度對(duì)菊花腦黃酮提取得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids from Chrysanthemum nankingense

由圖5可以看出，在水浴加熱條件下，水浴溫度低于70℃時(shí)，菊花腦中黃酮的提取得率隨著提取溫度的升高而增加，溫度繼續(xù)升高，黃酮的提取得率反而降低，這可能是因?yàn)樘崛囟鹊纳咂茐牧司栈X中某些黃酮，使提取得率降低，所以選擇水浴提取溫度70℃較為合適。

2.6 響應(yīng)面法提取菊花腦黃酮的試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、液料比4因素進(jìn)行組合中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面法提取菊花腦黃酮試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

采用Design Expert 7.1.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合后得到乙醇體積分?jǐn)?shù)X1、提取時(shí)間X2、提取溫度X3和液料比X4的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表3 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Significance analysis of each regression coefficient of the fitted regression model

以黃酮提取量為響應(yīng)值時(shí)，模型P＝0.0467＜0.0500，表明該二次方程模型顯著，即可以使用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。并對(duì)回歸方程作顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，在一次項(xiàng)中，各因素對(duì)黃酮提取得率的影響由大到小依次為提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時(shí)間，其中提取溫度的影響極顯著(P＜0.01)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響顯著(P＜0.05)。在交互項(xiàng)中，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間影響達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。因素間交互作用顯著的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。由圖6可知，響應(yīng)面開(kāi)口向下，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。從其等高線圖可以直觀地看出，等高線為橢圓形，證明提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取溫度和提取時(shí)間這兩組的兩個(gè)因素的交互作用顯著。

圖6 各因素交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of extraction parameters on extraction rate of flavonoids from Chrysanthemum nankingense

通過(guò)Design-Expert 7.1.6軟件得到的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78.20%、提取時(shí)間88.83min、提取溫度67.63℃、液料比41.05:1(mL/g)，預(yù)測(cè)響應(yīng)值為2.61mg/g。

采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將菊花腦黃酮提取最佳工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、提取時(shí)間89min、水浴溫度68℃、液料比41:1(mL/g)，實(shí)際測(cè)得的黃酮提取得率2.88mg/g。與周麗娜等[3]的研究結(jié)果菊花腦莖葉干品中總黃酮含量為0.203%有一定差異，這與菊花腦的來(lái)源、不同氣候及采摘期有一定的關(guān)系。

3 結(jié) 論

菊花腦黃酮最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)78%、提取時(shí)間89min、水浴溫度68℃、液料比41:1(mL/g)，實(shí)際測(cè)得的黃酮提取得率2.88mg/g，比理論預(yù)測(cè)值高0.27mg/g。因此，采用RSA法優(yōu)化得到的菊花腦黃酮提取條件參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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Optimization of Extraction Process for Flavonoids fromChrysanthemum nankingenseby Response Surface Methodology

LIU Jing-jing，ZHAO Hong-jun，HAN Yao-ping，WANG Xue-feng，DAI Yang-jun
(Department of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

Box-Behnken experimental design and response surface analysis were used to optimize the extraction of flavonoids fromChrysanthemum nankingense. The results showed that the optimal process conditions for the extraction of flavonoids fromChrysanthemum nankingensewere 78% ethanol solution as the solvent at a material-to-liquid ratio of 1:41, extraction time of 89 min, and extraction temperature of 68℃. Under these conditions, the yield of flavonoids was 2.88 mg/g.

Chrysanthemum nankingense；flavonoids；response surface methodology；extraction

Q946.83

A

1002-6630(2012)16-0068-04

2011-06-09

劉晶晶(1978—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸ず吞烊划a(chǎn)物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：ljj@cslg.edu.cn