李 琳，李穩(wěn)宏,*，雒 羽，趙 鵬，雷雨辰，滕家輝，馬 偉

(1.西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069；2陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物的制備及理化性質(zhì)研究

李 琳1，李穩(wěn)宏1,*，雒 羽1，趙 鵬2,3，雷雨辰1，滕家輝1，馬 偉1

(1.西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069；2陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

目的：研究二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物(LPC)的最佳合成工藝及其理化性質(zhì)。方法：采用響應(yīng)面分析法對(duì)LPC合成條件進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)LPC的水解及還原性實(shí)驗(yàn)判斷其在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性。結(jié)果：LPC的最佳合成工藝為水浴溫度73℃、多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量配比5:1、反應(yīng)液pH8，且理化性質(zhì)穩(wěn)定。結(jié)論：LPC具有較好的理化性質(zhì)，有望開(kāi)發(fā)成為一種新型的補(bǔ)鐵劑。

二色補(bǔ)血草；多糖鐵配合物；響應(yīng)面分析方法；理化性質(zhì)

二色補(bǔ)血草(Limonium bicolor)為藍(lán)雪科(Plumba ginaceae)補(bǔ)血草屬的多年生草本植物，別名蒼蠅花、蠅子草，主要分布于我國(guó)陜西、河北、山西、甘肅等地。二色補(bǔ)血草可全草入藥，性味甘、微澀苦、無(wú)毒。主要功效為補(bǔ)血、止血、散瘀、調(diào)經(jīng)、益脾、健胃等[1-2]，主治崩漏、尿血、月經(jīng)不調(diào)等癥[3-4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多糖鐵(Ⅲ)配合物作為補(bǔ)鐵劑不僅具有合適的配合穩(wěn)定性，對(duì)胃腸道無(wú)或甚少刺激作用，而且當(dāng)其釋放鐵之后，配體多糖具有多方面的生物活性，是對(duì)肌體有益的成分，不會(huì)產(chǎn)生毒副作用[5-8]。

鑒于二色補(bǔ)血草本身所具有的補(bǔ)血功能，本研究利用其為原料，從中提取二色補(bǔ)血草多糖，與鐵(Ⅲ)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，探討制備二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物的工藝路線，并對(duì)該配合物理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為將二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物開(kāi)發(fā)成為一種營(yíng)養(yǎng)型口服補(bǔ)鐵劑打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

二色補(bǔ)血草 西安萬(wàn)壽路中藥材批發(fā)市場(chǎng)；檸檬酸三鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、K4[Fe(CN)6]、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、正丁醇等均為分析純；LS-206型大孔樹(shù)脂 西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-2401紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、S7-AA-7000型原子吸收光譜儀 日本島津公司；DZF-602真空干燥箱上海申賢恒溫設(shè)備廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司；TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-2C酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 二色補(bǔ)血草多糖的制備

用95%乙醇對(duì)二色補(bǔ)血草進(jìn)行脫脂，將脫脂后的藥材置于圓底燒瓶中按一定的料液比加入蒸餾水，在熱水中浸提，趁熱抽濾，濃縮，加入一定量的無(wú)水乙醇醇沉，靜置得二色補(bǔ)血草粗多糖沉淀。后將粗多糖溶于水，用Sevag法除蛋白后，經(jīng)過(guò)LS-206型大孔樹(shù)脂進(jìn)行脫色，濃縮，醇沉，靜置，過(guò)濾，沉淀依次用乙醇、丙酮抽洗，真空干燥，得二色補(bǔ)血草多糖白色無(wú)定形粉末。經(jīng)過(guò)苯酚-硫酸法[9]測(cè)得多糖含量為48.9%。

1.2.2 LPC的合成工藝

稱取二色補(bǔ)血草純化多糖適量，檸檬酸三鈉0.5g，置于史萊克管中，溶于少量水中，置水浴中加熱并不斷攪拌。在不斷攪拌的過(guò)程中，同時(shí)緩緩交替滴加2mol/L三氯化鐵溶液和20%氫氧化鈉溶液，控制溶液的pH8.0～8.5。當(dāng)反應(yīng)液中出現(xiàn)棕紅色不溶性沉淀時(shí)，立即停止滴加FeCl3和NaOH溶液，繼續(xù)在熱水浴中攪拌1h。反應(yīng)液冷卻后，3500r/min離心15min。棄去沉淀，收集離心液。離心液中加入3倍量的無(wú)水乙醇，攪拌均勻，靜置后過(guò)濾，濾餅分別用甲醇、9 5%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚洗滌，真空干燥，得棕褐色二色補(bǔ)血草鐵(Ⅲ)粗品，后再對(duì)其進(jìn)行透析純化，去除粗品中的小分子雜質(zhì)，得二色補(bǔ)血草鐵(Ⅲ)。工藝流程見(jiàn)圖1。鐵含量的測(cè)定采用鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定[10]。

圖1 二色補(bǔ)血草多糖鐵合成工藝流程圖Fig.1 Flow chart of LPC preparation process

1.2.3 二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝優(yōu)化

依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，選取水浴溫度、多糖與檸檬酸三鈉配比、pH值3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 產(chǎn)品LPC中鐵含量測(cè)定[13]

采用GB 11911—1989《水質(zhì) 鐵、錳的測(cè)定：火焰原子吸收分光光度法》測(cè)定LPC中鐵的含量。原子吸收光譜條件：在50B原子吸收光譜儀上，用火焰法，在燈電流5.0mA、狹縫0.5nm、波長(zhǎng)248.3nm、火焰高度7.5mm、空氣流6.5L/min、乙炔流量1.5L/min。

1.2.5 產(chǎn)品LPC理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.5.1 產(chǎn)品LPC一般物理性質(zhì)測(cè)定

考察產(chǎn)品LPC的溶解性、熔點(diǎn)、溶液pH值等一般物理性質(zhì)，透析除鹽后的LPC溶于水，以K4[Fe(CN)6]檢驗(yàn)其水溶液，檢測(cè)Fe(Ⅲ)離子的特殊顯色效應(yīng)。

1.2.5.2 產(chǎn)品LPC的水解實(shí)驗(yàn)

補(bǔ)鐵劑在鐵吸收的主要部位——十二指腸是否可溶，是補(bǔ)鐵劑生物利用度高低的關(guān)鍵之一。對(duì)LPC、三氯化鐵、硫酸亞鐵3種含鐵劑進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，觀察它們?cè)诓煌琾H值時(shí)的穩(wěn)定情況。

配制含鐵濃度均為0.01mol/L的LPC、三氯化鐵、硫酸亞鐵溶液，各精密量取20mL，用0.01mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴定；同時(shí)用測(cè)定反應(yīng)溶液pH值變化情況。

1.2.5.3 產(chǎn)品LPC的還原性實(shí)驗(yàn)

采用鄰菲羅啉比色法對(duì)LPC進(jìn)行還原性實(shí)驗(yàn)，其基本原理為：在酸性條件下以抗壞血酸為還原劑，將多糖鐵中的三價(jià)鐵離子還原為二價(jià)，二價(jià)鐵離子與鄰菲羅啉生成一種紅色螯合物，根據(jù)其顏色的深淺得出溶液中鐵含量的高低。

量取1mmol/L的LPC溶液5.0mL，分別置于8個(gè)50mL容量瓶中，控制p H值分別為1、2、3、4、5、6、7、8，再分別加入10%抗壞血酸溶液1.0mL，0.12%鄰菲羅啉試劑5.0mL，定容至刻度，恒溫37℃水浴條件下還原，取不同時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)溶液于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，考察產(chǎn)品LPC的還原性，以不加LPC溶液作為空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝條件優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及擬合模型

響應(yīng)面面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 二色補(bǔ)血草多糖鐵(Ⅲ)配合物制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for Fe content of LPC with various extraction conditions

從表3可以看出，模型的顯著性F＝40.10＞0.05，r＝223.36/227.69＝0.9810，顯著性水平P＜0.001，表明模型顯著，此外模型方程失擬項(xiàng)很小，可認(rèn)為方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合情況較好，試驗(yàn)誤差小，因此能夠?qū)?shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測(cè)[11-12]。從方差分析表可以看出，反應(yīng)液pH值對(duì)提取影響最為顯著，其次是檸檬酸三鈉的質(zhì)量配比和水浴溫度。方程的一次、二次項(xiàng)顯著性水平P＜0.05，影響顯著，說(shuō)明各個(gè)試驗(yàn)的因子對(duì)響應(yīng)值的影響并非為線性關(guān)系。經(jīng)對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：

2.1.2 等高線圖和響應(yīng)面圖分析

利用Design Expert軟件對(duì)二次回歸方程優(yōu)化響應(yīng)面及等高線圖見(jiàn)圖2。

圖2 各兩因素交互作用對(duì)LPC鐵含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of synthesis conditions on Fe content of LPC

由圖2可知，反應(yīng)液pH值的影響最為顯著，曲面較陡；檸檬酸三鈉的質(zhì)量配比和水浴溫度次之，二者的曲面相對(duì)平滑一些。由回歸方程得到的優(yōu)化合成工藝條件為：水浴溫度72.8℃、多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量配比4.68:1、反應(yīng)液pH8.15?；貧w模型預(yù)測(cè)在此二色補(bǔ)血草多糖鐵合成最佳工藝條件下，多糖鐵中鐵含量為20.7774%。

按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最優(yōu)工藝條件修正為水浴溫度73℃、多糖與檸檬酸三鈉質(zhì)量配比5:1、反應(yīng)液pH8，通過(guò)3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到二色補(bǔ)血草多糖鐵中平均鐵含量為20.48%，與理論預(yù)測(cè)值吻合良好，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

2.2 產(chǎn)品LPC的鐵含量

產(chǎn)品LPC中鐵含量測(cè)定結(jié)果為20.27%，此結(jié)果表明：用鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定LPC中鐵含量的方法簡(jiǎn)捷快速，精密度高，鐵含量測(cè)定結(jié)果與原子吸收光譜法測(cè)定結(jié)果一致。

2.3 LPC的理化性質(zhì)

2.3.1 LPC的一般物理性質(zhì)

LPC是無(wú)定形棕褐色粉末，無(wú)臭、無(wú)味，易溶于水，其水溶液呈中性，有丁達(dá)爾現(xiàn)象，不溶于無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、乙醚等有機(jī)溶劑。熔點(diǎn)高于3 0 0℃。透析除鹽后的LPC溶于水，以K4[Fe(CN)6]檢驗(yàn)其水溶液，結(jié)果不顯示Fe(Ⅲ)離子的特殊顯色效應(yīng)。證實(shí)LPC水溶液中不存在游離的Fe3+，說(shuō)明生成了較為穩(wěn)定的配合物。

2.3.2 LPC的水解實(shí)驗(yàn)[14]

圖3 三種含鐵劑的NaOH滴定曲線Fig.3 NaOH titration curves of three kinds of iron supplements

由圖5可知，F(xiàn)eCl3開(kāi)始渾濁時(shí)的pH2.64，出現(xiàn)大量渾濁時(shí)的pH6.71。FeSO4開(kāi)始渾濁時(shí)的pH3.32，出現(xiàn)大量渾濁時(shí)的pH6.78。LPC在pH12時(shí)仍無(wú)渾濁。但是，當(dāng)pH值逐漸減小至3.5時(shí)，LPC開(kāi)始出現(xiàn)沉淀，并且pH值越小沉淀量越大。說(shuō)明LPC在pH3.5～10.5范圍內(nèi)具有特別的穩(wěn)定性，在強(qiáng)酸條件下LPC的結(jié)構(gòu)被破壞，生成了不溶物。

2.3.3 LPC的還原性實(shí)驗(yàn)[15]

圖4 二色補(bǔ)血草多糖鐵與抗壞血酸反應(yīng)體系的A-t曲線Fig.4 A-t curves of the reaction system between LPC and vitamin C

由圖4可知，LPC中的鐵可以被還原劑還原，30min內(nèi)幾乎可以全部溶出，溶出率達(dá)到100%?？梢?jiàn)LPC有良好的溶出被還原性能，可以說(shuō)明LPC作為口服補(bǔ)鐵劑可被食物中的某些還原性物質(zhì)將其中的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵，進(jìn)而被機(jī)體吸收利用，有較好的生物利用度，由于沒(méi)有游離的Fe3+存在，所以LPC對(duì)消化道無(wú)明顯的刺激作用。

3 討 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)以二色補(bǔ)血草為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)其合成多糖鐵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到合成LPC最佳工藝為水浴溫度73℃、多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量配比5:1、反應(yīng)液pH8。

3.2 產(chǎn)品LPC的鐵含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定LPC中鐵含量的方法簡(jiǎn)捷快速，精密度高，鐵含量測(cè)定結(jié)果與原子吸收光譜法測(cè)定結(jié)果吻合良好。

3.3 LPC溶于水呈深紅棕色透明溶液，有丁達(dá)爾現(xiàn)象，說(shuō)明LPC和氫氧化鐵溶液一樣，也是一種膠體溶液。據(jù)觀察，這種膠體溶液相當(dāng)穩(wěn)定，長(zhǎng)期放置不發(fā)生聚沉，顏色均一且透明。

3.4 口服補(bǔ)鐵劑的主要吸收部位是在十二指腸(pH6～7)，要求補(bǔ)鐵劑具有可溶性，并以此作為判斷補(bǔ)鐵劑生物利用度高低的主要指標(biāo)。由圖3、4可以看出LPC在生理pH條件下可溶且能夠穩(wěn)定存在，但作為口服補(bǔ)鐵劑不宜空腹服用(空腹時(shí)，胃液pH＜3)，并且三價(jià)鐵在pH1～8范圍內(nèi)能夠較迅速的還原成二價(jià)鐵，說(shuō)明LPC若作為補(bǔ)鐵劑可被食物中的還原性物質(zhì)(抗壞血酸)將三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵后被機(jī)體吸收，有較好的生物利用度，又因溶液中無(wú)游離的Fe3+存在，所以應(yīng)無(wú)明顯的消化道刺激作用。

[1] 吳冬青, 安紅鋼, 林敏, 等. 二色補(bǔ)血草不同部位總黃酮含量的測(cè)定[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2006, 23(1): 127-129.

[2] 張連茹, 鄒國(guó)林, 楊天鳴. 麻黃水溶性多糖的提取及其清除氧自由基作用的研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2000, 22(3): 65-67.

[3] SAS G, NEMESASZKY E, BRAUER H. On the therapcutic effects of trivalent and divalent iron deficiency anemia[J]. Arznelm-Forsch/Drug Res, 1984, 34(1): 1575-1579.

[4] ZHUSUPOVA G E, ARTAMONOVA N A, ABILOV Z A, et al. Lipophilic pigments and fatty acids from theaerial parts of certain plant species of the genusLimonium.Ⅶ[J]. Chemistry of Natural Compounds,2006, 42(5): 512-514.

[5] ANIYA Y, MIYAGI C, NAKANDAKARI A, et al. Free radical scavenging action of the medicinalherbLimonium wrightiifrom the Okinawa islands[J]. Phytomedicine, 2002, 9(3): 239-244.

[6] TANG X H, GAO J, CHEN J, et al. Mitochondrial modulation is involved in the hepatoprotection ofLmionium sinenseextractagainst liverdamage inmice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 120(3): 427-431.

[7] 王耀莉, 史鎖洪, 朱霖, 等. 多糖鐵復(fù)合物治療兒童缺鐵性貧血[J].新藥與臨床, 1994, 13(4): 251-252.

[8] 楊真, 歲海古. 缺鐵性貧血及補(bǔ)鐵劑研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 2006, 33(2): 90-93.

[9] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 2版. 杭州: 浙江大學(xué)出版社,1997: 11.

[10] 李玉賢, 游志恒, 褚意新. 百合多糖鐵復(fù)合物的合成及其鐵含量的測(cè)定[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2010, 16(7): 47-49.

[11] 崔易, 李穩(wěn)宏, 唐璇, 等. 胭脂蟲(chóng)紅色素提取工藝優(yōu)化研究[J]. 化學(xué)工程, 2007, 35(6): 66-69.

[12] 劉軍海, 任惠蘭, 官波, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化白術(shù)多糖提取工藝[J].中成藥, 2008, 30(5): 667-690.

[13] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)局. GB 11911—1989 水質(zhì)鐵、錳的測(cè)定: 火焰原子吸收分光光度法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1989.

[14] 王凱平, 張玉, 戴立泉. 當(dāng)歸多糖鐵理化性質(zhì)的初步研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2006, 31(9): 747-750.

[15] 李玉賢, 裴曉紅. 大棗多糖鐵(Ⅲ)配合物的合成及一般性質(zhì)研究[J].中成藥, 2006, 28(5): 707-709.

Synthesis and Physicochemical Properties ofLimonium bicolorPolysaccharide-Fe (Ⅲ) Complex

LI Lin1，LI Wen-hong1,*，LUO Yu1，ZHAO Peng2,3，LEI Yu-chen1，TENG Jia-hui1，MA Wei1
(1. College of Chemistry Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, China；2. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China；3. State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)

Objective: To explore the best synthetic process ofLimonium bicolorpolysaccharide-Fe (III) complex (LPC) and its physical and chemical properties. Methods: The synthetic process conditions were optimized by response surface methodology.The stability of LPC under physiological conditions was evaluated by its hydrolysis characteristics and reducibleness. Results: The optimal synthetic conditions were water bath temperature of 73℃, polysaccharides-to-C6H5Na3O7·2H2O ratio of 5:1 and reaction pH of 8. The prepared LPC was stable under physiological pH environment. Conclusion: LPC has excellent physicochemical properties and can be used as a new iron supplement.

Limonium bicolor；polysaccharide-Fe (Ⅲ)；response surface methodology；physicochemical properties

R284.1

A

1002-6630(2012)16-0054-05

2011-06-16

陜西省教育廳專項(xiàng)(2010JK521)

李琳(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幱没钚猿煞址蛛x純化。E-mail：lilinsidan@sina.com

*通信作者：李穩(wěn)宏(1950—)，男，教授，研究方向?yàn)樘烊簧锾崛?、分離與純化。E-mail：liwenhong@nwu.edu.cn