唐姍，胡嶸，孫佳明，張輝

（長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117）

糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，臨床以高血糖、葡萄糖耐量減低及胰島素釋放異常為主要標志。隨著2型糖尿病的藥物治療已經(jīng)取得了一定進展，α-葡萄糖苷酶抑制劑以其見效快且毒副作用小成為治療2型糖尿病的一類新型藥物[1]。α-葡萄糖苷酶位于小腸刷狀緣膜上皮細胞，它能將雙糖，如蔗糖、麥芽糖等水解成可被小腸吸收的單糖，是食物中碳水化合物水解的關(guān)鍵酶。因此，抑制該酶活性能夠延緩碳水化合物在腸道的吸收，減少葡萄糖吸收入血，達到防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥的目的[2-3]。

參連湯出自 《萬病回春》，由人參、黃連組成，有補氣養(yǎng)陰，清熱燥濕之功?，F(xiàn)代藥理研究證實，人參黃連藥對能夠調(diào)節(jié)空腹血糖、血胰島素，改善胰島素抵抗，被廣泛地應(yīng)用于糖尿病的臨床治療[4]。

本實驗通過比較不同溶劑制備的參連湯樣品及其有效組分黃連總生物堿、人參總皂苷的不同比例配伍樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，對古方及有效組分配伍的降糖作用進行評價，為合理開發(fā)古方參連湯提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品

人參、黃連藥材購于長春宏檢大藥房，均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學張輝教授鑒定為正品；黃連總生物堿（實驗室自制，已申請發(fā)明專利，申請?zhí)?01110243033.5），經(jīng)紫外分光光度法，在波長349 nm檢測總堿純度＞99%；人參總皂苷（宏久參業(yè)科技股份有限公司，純度＞75%）。

1.2 試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶（美國Sigma公司）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純。酶標儀（Bio-Rad）；旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）；96微孔板，各型號移液槍及槍頭等。

2 方法

2.1 有效組分黃連總生物堿、人參總皂苷配伍組合

如表1所示。

表1 黃連總生物堿、人參總皂苷配伍比例

2.2 參連湯樣品的制備

2.2.1 水煎煮樣品 取人參藥材粗粉10 g，黃連藥材粗粉20 g，加14倍量水煎煮3次，每次3.5 h，濾過，合并濾液，減壓干燥得干膏，粉碎備用。

2.2.2 乙醇回流樣品 取人參藥材粗粉10 g，黃連藥材粗粉20 g，加20倍量85℃70%乙醇回流提取4次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓干燥得干膏，粉碎備用。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

根據(jù)已有方法[5]改進，實驗共設(shè)陰性、空白、樣品3個組，每組平行3個孔，按表2加入各溶液，37℃溫育15 min，各孔加入180μL葡萄糖測定試劑，37℃溫育15 min，于490 nm波長下測定OD值。采用葡萄糖氧化酶法，以葡萄糖的生成量計算α-葡萄糖苷酶抑制活性，酶活性抑制率（%）＝（陰性-樣品）／（陰性-空白）×100%。樣品設(shè)定1，2，3，4，5 mg·mL-15個濃度，以抑制率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標繪制得到抑制率曲線，并計算相應(yīng)IC50值。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定加入溶液／μL

2.4 葡萄糖氧化酶抑制活性測定

按2.3項下方法測定配伍2組受試藥物對葡萄糖氧化酶抑制活性，實驗共設(shè)陰性、空白、樣品3個組，每組平行3個孔，按表3加入各溶液，37℃溫育15 min，各孔加入180μL葡萄糖測定試劑，37℃溫育15 min，于490 nm波長下測定OD值。以葡萄糖的生成量計算葡萄糖氧化酶抑制活性，酶活性抑制率（%）＝（陰性-樣品）／（陰性-空白）×100%。樣品設(shè)定1，2，3，4，5 mg·mL-15個濃度，計算抑制率。

表3 葡萄糖氧化酶抑制活性測定加入溶液／μL

3 結(jié)果

3.1 不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性

按2.3項下對各組樣品進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測定，實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，結(jié)果用±s表示，如表4所示。

表4 不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n＝3）

表4 不同樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n＝3）

注：*P＜0.01

組別 IC50／mg·mL-1配伍1組2.0952±0.1204配伍2組 1.2209±0.0828*配伍3組 2.3801±0.1487配伍4組 3.5346±0.1710配伍5組 3.5692±0.0894參連湯水煎煮組 2.7426±0.1324參連湯乙醇回流組2.1621±0.1718

在實驗測定范圍內(nèi)，參連湯與有效組分各配伍組對α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，尤其是黃連總生物堿與人參總皂苷配伍2組（8∶2）最佳，大于乙醇回流提取組和水煎煮提取組。

3.2 不同樣品的葡萄糖氧化酶抑制活性

按2.4項下對配伍2組樣品進行葡萄糖氧化酶抑制活性測定，結(jié)果用±s表示，如表5所示。

表5 不同樣品的葡萄糖氧化酶抑制活性（±s，n＝3）

表5 不同樣品的葡萄糖氧化酶抑制活性（±s，n＝3）

注：表中-為負值，無意義

濃度／mg·mL-1 12 34 5抑制率／% （1.89±0.1264）（0.24±0.1703）---

從表5可知，配伍2組受試藥物對葡萄糖氧化酶幾乎沒有抑制作用，2.3項下建立的篩選模型可以避免藥物對葡萄糖氧化酶活性的影響，避免假陽性的出現(xiàn)。另外，2.3項下為7組樣品平行試驗，即使存在對葡萄糖氧化酶抑制作用，也屬于系列誤差，對組間比較無明顯影響。

4 討論

本試驗選擇了以直接水解物蔗糖為底物的篩選模型，具有以下優(yōu)點：（1）經(jīng)濟、快捷，篩選僅需微量樣品，靈敏度高，可進行體外高通量篩選；（2）篩選得到的 α-GI（α-葡萄糖苷酶抑制劑）靶向作用具體，作用機制確切。（3）與PNPG底物篩選模型相比，假陽性率較低，具有定向篩選的特點[1]。因此，選擇以蔗糖為底物的酶-抑制劑-96微孔板篩選模型是一種行之有效的α-GI篩選方法。

對不同提取方法制備的參連湯及其有效組分配伍組合的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究，發(fā)現(xiàn)各組均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。從數(shù)據(jù)直觀分析，不同提取方法的參連湯樣品比較，乙醇回流提取的抑制活性高于水煎煮提取，說明古方的傳統(tǒng)提取工藝有一定的限制性，未能將參連湯中α-GI充分煎出，而采用乙醇回流法提取，能夠提高α-GI的提取效率。

單用黃連總生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于單用人參總皂苷，當二者配伍時，隨著黃連總生物堿比例的逐漸增大，抑制活性逐漸增強。尤其是配伍2組（黃連總生物堿與人參總皂苷8∶2）的IC50值最小，說明黃連總生物堿在配伍樣品中可能起主導(dǎo)作用，而人參總皂苷為協(xié)同促進作用。

在實驗范圍內(nèi)的有效組分最優(yōu)配伍是黃連總生物堿與人參總皂苷8∶2，即4∶1。根據(jù)黃連中總生物堿含量約為8%[6]，人參中總皂苷含量約為4%[7]，折合成原藥材量比例為黃連-人參（2∶1），正與參連湯古方組成相吻合。而有效組分配伍時的抑制活性遠高于傳統(tǒng)古方藥材的提取樣品，說明黃連總生物堿、人參總皂苷是參連湯中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性部位。經(jīng)過現(xiàn)代工藝，將黃連、人參的有效組分進行提取和配伍，形成復(fù)方組分中藥，既具有現(xiàn)代藥學的先進性，又有中醫(yī)藥復(fù)方聯(lián)合用藥的傳統(tǒng)特點[8]。由于是由純度更高的有效組分提取物所組成，因而不僅能夠提高藥效，更重要的是便于進行藥效作用機制、藥物代謝等深入的研究，進而明確每個組分對參連湯功能主治所貢獻的藥效學作用及其作用機制，也可以進一步闡明各個組分之間的相互作用的性質(zhì)[9]，進一步為參連湯治療糖尿病做出貢獻。