劉國榮，孫 勇，李平蘭*

(1.北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京重點實驗室，北京 100048；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

Ⅱa類乳酸菌細菌素的異源表達研究進展

劉國榮1,3，孫 勇2，李平蘭3,*

(1.北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京重點實驗室，北京 100048；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

Ⅱa類乳酸菌細菌素由于其對單核細胞增生李斯特菌的強烈抑菌活性，已成為天然食品防腐劑研究與開發(fā)的熱點。但是受生物合成調(diào)控系統(tǒng)控制，天然細菌素的產(chǎn)量往往很低而且提取過程較為復雜，很難滿足相關(guān)研究和實際應用的需求。為此，許多研究者進行過Ⅱa類細菌素的異源表達研究，本文對該類細菌素在大腸桿菌、乳酸菌以及酵母菌中的異源表達研究作較為全面系統(tǒng)的綜述，并指出目前存在的主要問題及今后的研究方向。

Ⅱa類乳酸菌細菌素；單核細胞增生李斯特菌；異源表達

乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物與人類的健康密切相關(guān)，常常被有意識地引進食品產(chǎn)品或自然地發(fā)生在食品中，從而使食品擁有人們渴望的風味、結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)及安全性。乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有無毒、無殘留，高效、耐酸、耐高溫、無抗藥性等特點，目前已成為天然防腐劑研究與開發(fā)的熱點[1-2]。

Ⅱa類乳酸菌細菌素，是指一類具有共同N端YGNGVXaaC序列的抗李斯特菌的小肽，它們是乳酸菌細菌素中數(shù)量最多且研究最為深入的一群，主要包括片球菌素(pediocin)、腸球菌素(enterocin)等小分子細菌素。這類細菌素不僅可以強烈抑制食源性病原菌單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocylogenes)的生長，而且對某些腐敗乳酸菌、索絲菌(Brochotrixspp.)、梭狀桿菌(Clostridiumspp.)、芽孢桿菌(Bacillusspp.)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)等都表現(xiàn)有明顯抑制作用，具有很好的控制食品腐敗菌及病原菌的潛在應用價值。此外，與其他細菌素相比，Ⅱa類細菌素的抑菌活性較強且具有良好的物理化學性質(zhì)，是目前公認的最有希望應用于多種工業(yè)用途的細菌素[3-4]。

目前，Ⅱa類乳酸菌細菌素的獲得主要是通過天然生物合成，但是由于其受調(diào)控系統(tǒng)的影響，產(chǎn)量往往比較低，而且從機體中提取步驟復雜、得率低，不足以進行抑菌作用機制、構(gòu)效關(guān)系及開發(fā)應用研究。另有少量研究報道可以采用化學方法合成細菌素，它是依據(jù)細菌素的天然氨基酸序列和活性結(jié)構(gòu)特點，通過固相法合成的細菌素或類似物，但是價格比較昂貴，也很難滿足細菌素相關(guān)研究和實際應用的需求。隨著Ⅱa類細菌素遺傳學特征的深入研究及基因工程技術(shù)的廣泛應用，很多學者發(fā)現(xiàn)通過異源分泌表達生產(chǎn)細菌素可克服這些不足。已有研究顯示，不同來源的不同屬、種的乳酸菌可以產(chǎn)生相似的Ⅱa類細菌素，這說明編碼Ⅱa類細菌素的基因在不同菌株之間是可以轉(zhuǎn)移的[5-7]。

許多實踐證明，通過異源表達生產(chǎn)Ⅱa類乳酸菌細菌素可以：1)提高細菌素的產(chǎn)量，以便進行細菌素的作用模式、結(jié)構(gòu)與功能及應用性研究；2)減少在目標細胞中細菌素抗性的發(fā)生，提高其在食品中的抗菌效率；3)在更安全的宿主中生產(chǎn)細菌素；4)構(gòu)建出對多種不良微生物都有抑菌活性的細菌素產(chǎn)生菌；5)構(gòu)建出對食品環(huán)境有更好適應性的重組宿主；6)為乳酸菌提供更好的抗菌特性，使其在作為食品發(fā)酵劑、益生菌制劑、飼料添加劑等時能更好的發(fā)揮作用[8]。Ⅱa類乳酸菌細菌素的異源表達研究，不僅可為全面解析Ⅱa類乳酸菌細菌素的異源分泌機制提供直接證據(jù)，也可為Ⅱa類乳酸菌細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)和應用提供有效途徑，并進一步推動我國食品天然生物防腐劑的快速發(fā)展。

近年來，有許多研究學者進行了乳酸菌細菌素異源表達研究，取得了大量的重要成果。本文重點綜述了Ⅱa類乳酸菌細菌素在大腸桿菌、乳酸菌以及酵母菌中的異源表達研究。

1 Ⅱa類乳酸菌細菌素的異源表達概況

乳酸菌細菌素異源表達或基因工程技術(shù)的研究從20世紀90年代開始，在國外逐漸成為熱點，尤其在歐洲諸國研究居多，國內(nèi)近五年開始出現(xiàn)報道。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，已有近20種乳酸菌細菌素在10多種宿主菌中表達，使用的表達宿主包括大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌等，其中表達的Ⅱa類乳酸菌細菌素主要有Pediocin PA-1、Enterocin A、Enterocin P、Carnobacteriocin B2、Divercin V41、Piscicolin 126、Mesentericin Y105、Plantaricin 423、Hiracin JM79等，見表1。

表1 已報道Ⅱa乳酸菌類細菌素異源表達Table 1 Previous studies on the heterogenous expression of class Ⅱa bacteriocins from lactic acid bacteria

2 大腸桿菌異源表達系統(tǒng)

大腸桿菌是細菌素異源表達研究中使用最多的宿主，這首先是因為大多數(shù)乳酸菌細菌素對大腸桿菌并不表現(xiàn)抑制活性，所以不必擔心細菌素對宿主菌的細胞毒性作用。其次是因為大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最完善的異源表達體系，它的主要優(yōu)點包括：人們對其遺傳背景、分子生物學特點、生物化學特性等方面有較深入的認識，易于人為改造；很多目的基因在大腸桿菌中都能迅速而有效地表達出目的蛋白，通常能獲得目的蛋白占總蛋白30%～40%的工程菌株；大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡單，表達條件易于控制，生產(chǎn)成本低廉；很多成熟的表達載體及宿主菌組合可供選擇，研究者可根據(jù)需要選擇最適組合。目前大腸桿菌表達系統(tǒng)已被廣泛用于各種工具酶的生產(chǎn)、抗原及疫苗的制備、細胞因子的生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)生物學的研究等方面[28]。

對Ⅱa類細菌素而言，由于大腸桿菌不能編碼前導肽切除酶，不能對Ⅱa類細菌素前體的前導肽進行切除，因此，通常采用的表達策略是直接將成熟Ⅱa類細菌素基因編碼序列克隆到大腸桿菌表達系統(tǒng)中，利用大腸桿菌自身的分泌機制進行分泌表達。產(chǎn)物多數(shù)不能成功分泌到胞外，大部分以胞內(nèi)融合蛋白形式表達，而且產(chǎn)物產(chǎn)量和活性差異較大且其分離純化過程涉及細胞裂解、酶解等，過程繁瑣，成本較高[8]。另外，大腸桿菌高效表達系統(tǒng)還容易形成包涵體，致使重組蛋白的提取、純化及復性過程更加困難。此外，由于大腸桿菌菌株本身不具有食品應用特性，因此僅表達產(chǎn)物可用于食品工業(yè)，有一定的局限性。

近年來，已有許多Ⅱa類細菌素在大腸桿菌中的異源表達研究報道。早在1998年，Miller等[29]就利用PMAL-p2x載體在大腸桿菌中分泌表達了麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)-pediocin AcH，并發(fā)現(xiàn)該融合蛋白具有與天然Pediocin AcH相似的生物學活性。這個實驗首次證明了可以利用大腸桿菌的標準信號肽依賴機制進行Ⅱa類細菌素的功能性分泌表達。隨后，其他一些Ⅱa類細菌素利用大腸桿菌異源表達生產(chǎn)的研究也陸續(xù)被報道，如Moon等[19]將Pendiocin PA-1成熟肽基因與帶有His-tag的倉鼠二氫葉酸還原酶基因序列融合，在大腸桿菌細胞質(zhì)內(nèi)成功表達了His-tag-倉鼠二氫葉酸還原酶-pendiocin PA-1，并發(fā)現(xiàn)在利用Xa因子蛋白酶切除融合標簽后，重組Pendiocin PA-1具有與天然細菌素相似的活性，但是產(chǎn)量僅有0.06mg/L。如Richard等[11]依據(jù)大腸桿菌密碼子嗜好性，設(shè)計合成Divercin V41成熟肽基因，與表達載體pET-32b中的含有硫氧還原蛋白基因的核苷酸序列融合，在大腸桿菌細胞質(zhì)內(nèi)成功表達了可溶性的硫氧還原蛋白-His-tag-divercin V41，該重組蛋白切除融合標簽后具有較高的抗李斯特菌活性，純化后產(chǎn)量可達23mg/L。又如Gibbs等[25]將細菌素Piscicolin 126基因片段克隆到表達載體pET-32a上，并配合使用能夠在細胞質(zhì)內(nèi)形成二硫鍵的宿主菌，融合表達了硫氧還原蛋白-piscicolin 126，切除融合標簽后的重組Piscicolin 126具有生物活性，且產(chǎn)量高達26mg/L。通過這些成功的例子可以看出，采用以上表達系統(tǒng)可以獲得大量可溶性的融合目的蛋白，但是存在的共同問題就是目的蛋白只有在切除融合標簽后才顯示與天然細菌素相似的抑菌活性，不利于細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)和應用。

本課題組前期研究建立了Ⅱa類細菌素Enterocin P在大腸桿菌中的高效異源表達系統(tǒng)，所得重組細菌素產(chǎn)量高達32mg/L[5,30]。該系統(tǒng)所采用的表達載體為pET-22b(+)，它的N端含有pelB信號肽序列，為分泌型表達載體，它可以增加重組蛋白的溶解性、引導其穿過細胞質(zhì)膜，進入細胞周質(zhì)內(nèi)。而由于細胞周質(zhì)的氧化環(huán)境更有利于蛋白折疊和二硫鍵的形成，所以有利于獲得可溶的活性蛋白[31]。此外，該載體C端含有6×His標簽序列，該融合標簽的存在有利于在天然條件下用金屬親和層析純化融合蛋白并阻止大腸桿菌細胞內(nèi)蛋白酶對細菌素的降解，同時重組蛋白分子上僅融合了6個組氨酸短肽，可使重組細菌素在結(jié)構(gòu)和特性上都更加接近天然Enterocin P。

3 乳酸菌異源表達系統(tǒng)

已有許多研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生細菌素的發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中可以防止或抑制不良菌的污染，因而將產(chǎn)細菌素的乳酸菌加入到食品中比直接加細菌素更簡便、安全。但是并不是所有的工業(yè)乳酸菌都可產(chǎn)生細菌素，產(chǎn)生細菌素的菌株也并不一定適應細菌素發(fā)揮作用的環(huán)境，因此可以將細菌素基因?qū)氩划a(chǎn)生細菌素的發(fā)酵劑菌株中而使其獲得細菌素產(chǎn)生的能力，既可以發(fā)酵食品，又可以抑制食品中的腐敗菌和病原菌。而且不同的食品級乳酸菌菌株可基于它們在特定食品中的特性被選擇在不同食品中作為細菌素宿主，從而可構(gòu)建出適應于不同類型食品的細菌素產(chǎn)生菌株。

與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比較，乳酸菌表達系統(tǒng)獲得相對困難，但是乳酸菌本身安全且能夠?qū)⒛康牡鞍追置诘桨?，可放心應用于食品工業(yè)化生產(chǎn)[8]。截止目前，以乳酸菌為宿主異源表達細菌素的研究報道非常少，存在的主要問題是細菌素異源分泌表達水平太低，如Sanchez等[18]利用乳酸乳球菌表達細菌素Hiracin JM79，獲得了胞外活性重組細菌素，但是抑菌活性明顯低于原宿主菌株。

此外，還有許多學者致力于構(gòu)建完全食品級異源表達系統(tǒng)來生產(chǎn)Ⅱa類乳酸菌細菌素。這是考慮到傳統(tǒng)的乳酸菌表達載體大多以紅霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作為篩選標記，雖然這可以為遺傳操作保持一定的選擇壓力并有效選擇轉(zhuǎn)化子，但是將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內(nèi)，由于存在抗性因子轉(zhuǎn)移的隱患，可能帶來生物安全性的嚴重后果，所以從食品安全角度考慮，含抗生素抗性基因標記的微生物不能應用于食品生產(chǎn)中[32]。而為了防止使用抗生素抗性標記所引起的危害，最有效的辦法是選用對人體安全的食品級篩選標記替代抗生素抗性標記以構(gòu)建食品級受體及載體系統(tǒng)。

本課題組前期也研究了Ⅱa類細菌素Enterocin P在食品級乳酸菌中的異源表達與分泌，所使用的是食品級表達載體pLEB590，該載體完全以乳酸乳球菌DNA構(gòu)建的，它包含pSH 7l復制子，組成型啟動子P45，并以Nisin免疫基因nisI為標記基因[16]。對Nisin敏感的宿主菌因電轉(zhuǎn)化導入pLEB590而對Nisin產(chǎn)生免疫性，這為它的應用帶來了極大的方便。此外，提供選擇壓力的物質(zhì)Nisin是公認安全的天然食品防腐劑，且nisI基因來源于乳酸菌自身，這使得將nisI基因作為乳酸菌食品級篩選標記更有優(yōu)勢。該研究結(jié)果不但拓展了乳酸乳球菌食品級表達載體的應用范圍，而且為開發(fā)產(chǎn)Ⅱa類細菌素的工業(yè)化發(fā)酵劑、益生菌制劑等奠定了堅實基礎(chǔ)。目前，課題組在驗證了pLEB590能夠表達Ⅱa類細菌素基因的基礎(chǔ)上，開始對載體pLEB590進行改進，將組成型啟動子P45換成誘導型啟動子，如PnisA-MCSTpepN。即構(gòu)建以nisI作為食品級選擇標記的NICE高效誘導表達系統(tǒng)。

4 酵母菌異源表達系統(tǒng)

酵母菌是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。而且某些酵母表達系統(tǒng)具有外分泌信號序列，能夠?qū)⑺磉_的外源蛋白質(zhì)分泌到細胞外，因此很容易純化。

以酵母菌為宿主異源表達細菌素的報道相對較少，其表達宿主菌主要有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。目前，存在的主要問題是宿主特異性使得產(chǎn)物常常出現(xiàn)無活性或活性很低的現(xiàn)象，如Sanchez等[18]利用畢赤酵母表達細菌素HirJM79，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基對其抑菌活性影響較大，重組細菌素的產(chǎn)量明顯高于野生菌株，但是活性卻遠不及野生菌；van Reenen等[26]利用釀酒酵母表達Plantaricin 423，其工程菌表現(xiàn)出了抑菌活性，但培養(yǎng)上清液中卻未檢測出抑菌能力。Beaulieu等[22]利用畢赤酵母表達片球菌素Pediocin PA-1，雖然獲得了胞外的重組片球菌素，但卻未檢測出生物抑菌活性。以上均表明構(gòu)建高產(chǎn)且高活性細菌素的酵母工程菌是可行的，但仍需探索更為優(yōu)良的表達體系。

5 結(jié) 語

縱觀Ⅱa類細菌素異源表達研究現(xiàn)狀可以看出，構(gòu)建高產(chǎn)且高活性細菌素的基因工程菌是可行性的，但存在以下主要問題：細菌素的異源分泌水平太低；某些異源表達系統(tǒng)僅適合特定菌株及細菌素。除解決以上問題外，未來還可以進行以下幾個方面的探索研究。

5.1 在用于食品發(fā)酵的乳酸菌中表達外源Ⅱa類細菌素基因

并不是所有的工業(yè)乳酸菌都可產(chǎn)生細菌素，產(chǎn)生細菌素的菌株也并不一定適應細菌素發(fā)揮作用的環(huán)境，因此可以將細菌素基因?qū)氩划a(chǎn)生細菌素的發(fā)酵劑菌株中而使其獲得細菌素產(chǎn)生的能力，既可以發(fā)酵食品，又可以抑制食品中的腐敗菌和病原菌，甚至可以根據(jù)不同食品級乳酸菌菌株在特定食品中的特性而選擇不同食品級乳酸菌作為細菌素異源表達宿主，進而構(gòu)建出適應于不同類型食品的細菌素產(chǎn)生菌。

5.2 建立Ⅱa類乳酸菌細菌素在芽孢桿菌中的異源表達系統(tǒng)

由于芽孢桿菌表達載體轉(zhuǎn)化效率低、表達產(chǎn)物量少以及產(chǎn)物活性受環(huán)境影響大等因素，使得有效芽孢桿菌分泌表達系統(tǒng)的構(gòu)建和獲得非常困難，目前有關(guān)細菌素在芽孢桿菌中的異源表達還未見研究報道。但是芽孢桿菌具有良好的分泌特性，其發(fā)酵工藝和產(chǎn)物回收技術(shù)也較為成熟，用作細菌素的分泌型宿主菌，具有很大的潛力。

5.3 將無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)應用于Ⅱa類細菌素的重組表達

近幾年，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)迅速發(fā)展，該系統(tǒng)能使外源基因在體外快速表達，避免了細胞體系中宿主菌的復雜調(diào)控和新陳代謝帶來的干擾，以及基因工程菌表達抗菌肽時對宿主的毒性作用，可以成為Ⅱa類細菌素重組表達的一種有效手段。然而，到目前為止，國內(nèi)外只有謝燕[33]利用大腸桿菌無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)實現(xiàn)了Ⅱa類細菌素NB-C1融合蛋白的可溶性表達。這說明有關(guān)Ⅱa類細菌素在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的重組表達研究上還存在很大的探索和發(fā)展空間。

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Research Advances in Heterologous Expression of ClassⅡa Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria

LIU Guo-rong1,3，SUN Yong2，LI Ping-lan3,*
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Class Ⅱa bacteriocins from lactic acid bacteria, which have a strong antibacterial activity againstListeria monocytogenes, have become a hot topic in the research and development of natural preservatives. However, the bacteriocins are always produced at very low levels under the control of the biosynthesis regulatory system and their extraction is very complex, which makes it very difficult to meet the demands for relevant studies and practical applications. For this reason, the heterogenous expression of classⅡa bacteriocins has been widely studied in recent years. This paper summarizes a comprehensive systematic review of recent studies on the heterogenous expression of the bacteriocins inE. coli, lactic acid bacteria and yeast and points out the current main problems and future research directions.

classⅡa bacteriocins；Listeria monocytogenes；heterologous expression

Q939.117

A

1002-6630(2012)05-0323-05

2011-12-12

北京工商大學青年教師科研啟動基金項目(QNJJ2011-042)；國家自然科學基金項目(31071591)

劉國榮(1983—)，女，講師，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn

*通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向為乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物的理論與應用。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn