張海蓮，高麗萍*，冷洪濤，李 貞

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

枸杞多糖提取物對(duì)順鉑誘發(fā)大鼠腎毒性的影響

張海蓮，高麗萍*，冷洪濤，李 貞

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

目的：觀察枸杞多糖(LBP)對(duì)順鉑所致腎毒性的防護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法：將50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、順鉑(CDDP)模型組、LBP低、中、高劑量組(277、554、1008g/(kg·d))(以體質(zhì)量計(jì))。空白對(duì)照組和CDDP組每天灌胃蒸餾水，LBP組每天灌胃LBP，每日1次，灌胃10d后，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，其余各組一次性腹腔注射CDDP 7.0mg/kg建立腎損傷動(dòng)物模型，之后繼續(xù)灌胃5d。腹腔注射后第5天宰殺大鼠，檢測(cè)大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)的含量、腎組織中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果：給予LBP可顯著降低CDDP引起的BUN、Scr、MDA水平升高(P＜0.05或P＜0.01)；并能降低CDDP導(dǎo)致的NO含量和NOS活性的升高(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論：LBP經(jīng)口給予能減輕CDDP所致的腎損傷，其機(jī)制可能與其降低NOS活性和MDA、NO含量有關(guān)。

順鉑；枸杞多糖；腎毒性；一氧化氮；丙二醛；一氧化氮合酶；超氧化物歧化酶

順鉑(CDDP)是一種廣泛應(yīng)用的抗癌藥物。臨床研究表明，CDDP抗癌作用強(qiáng)，與其他抗腫瘤藥物無交叉抗藥性，在多種惡性腫瘤的治療中取得了顯著的療效[1-2]，是目前較有希望的一種抗癌藥物。但CDDP有廣泛的毒性，特別是嚴(yán)重的腎毒性，限制了它在臨床上的應(yīng)用[3]。目前，CDDP所致腎毒性的確切機(jī)制尚不十分清楚，研究表明CDDP誘發(fā)腎毒性是一個(gè)復(fù)雜的過程，大致可分為3種主要的病理改變：細(xì)胞毒、炎癥和纖維增生[4]?；钚匝跏荂DDP誘發(fā)急性腎損傷的主要原因[4]。目前，許多學(xué)者致力于減輕CDDP腎毒性的研究，但迄今為止在臨床上可應(yīng)用的藥物甚少。多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的活性，從而起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用。近年來，枸杞及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)已成為研究焦點(diǎn)[5]。枸杞子是傳統(tǒng)的名貴中藥材又是食品，枸杞多糖(L y c i u m b a r b a r u mpolysaccharides，LBP)是枸杞中的主要功能活性成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，枸杞具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抑制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞突變等[6-11]藥理作用，LBP對(duì)CDDP誘發(fā)腎毒性的影響尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用CDDP誘發(fā)大鼠腎損傷，通過觀察大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、腎組織一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)活性變化，研究LBP對(duì)CDDP所致腎毒性的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

成年健康雄性SD大鼠50只(SPF級(jí))，體質(zhì)量140～160g，由軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

順鉑(CDDP)，批號(hào)001001DF，注射用凍干型粉劑，每支10mg，山東齊魯制藥廠生產(chǎn)，用時(shí)用生理鹽水配制；枸杞多糖(LBP，純度30%) 上海康舟真菌多糖有限公司(批號(hào)20100607)，用時(shí)用雙蒸水稀釋；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)試盒、NO、NOS、SOD、MDA試劑盒南京建成生物工程研究所。

TDL-5-A型常溫低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；5840R型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendrof公司；HH·S1-Ni型電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；MQx-200型微孔板分光光度計(jì) 基因有限公司；Selectra-E-Plus型金自動(dòng)生化分析儀 荷蘭威圖科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

大鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)4d后，稱體質(zhì)量后隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組，CDDP模型組，LBP低、中、高劑量組，每組10只。

空白對(duì)照組和CDDP模型組每天灌胃蒸餾水1mL，LBP低、中、高劑量組((277、554、1008g/(kg·d))(以體質(zhì)量計(jì))每天灌胃相應(yīng)劑量的LBP水溶液(約1mL)[12]，連續(xù)15d，第10天時(shí)CDDP模型組和LBP組一次性腹腔注射CDDP 7.0mg/kg(以體質(zhì)量計(jì))可以引起腎毒性[13]，建立腎損傷動(dòng)物模型。空白對(duì)照組注射等量的生理鹽水。每天定時(shí)給與飼料并稱質(zhì)量，每2d換一次飲用水，每7d換一次墊料，每2d記錄各組大鼠的體質(zhì)量和LBP配制溶液的量。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

注射CDDP 5d后處死大鼠，股動(dòng)脈取血，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)檢測(cè)血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)的含量，取血后頸椎脫臼處死大鼠，冰浴狀態(tài)下剖腹取雙側(cè)腎臟，去被膜并稱腎質(zhì)量，計(jì)算腎臟系數(shù)(用腎質(zhì)量/體質(zhì)量比值表示)，腎臟系數(shù)以每100g體質(zhì)量對(duì)應(yīng)腎臟質(zhì)量表示。將腎臟組織放入10mL的小燒杯內(nèi)，用生理鹽水將其制成10%組織勻漿，3000r/min，4℃離心15～20min，取上清液按試劑盒說明書測(cè)蛋白質(zhì)含量、MDA含量、SOD活性、NO含量和NOS活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般變化

表1 給予順鉑前后各組大鼠體質(zhì)量的變化(±s，n=50)Table 1 Body weight changes in rats before and after cisplatin injection(±s，n=50)

表1 給予順鉑前后各組大鼠體質(zhì)量的變化(±s，n=50)Table 1 Body weight changes in rats before and after cisplatin injection(±s，n=50)

組別 體質(zhì)量/g灌胃LBP 5d后給予順鉑前 給予順鉑后第2天空白對(duì)照組 255.83±20.88 278.79±21.99 CDDP模型組 256.62±14.83 241.55±17.65 LBP低劑量組 257.68±11.49 244.35±14.15 LBP中劑量組 256.18±11.36 246.23±15.80 LBP高劑量組 259.40±11.86 245.56±15.40

從表1可以看出，注射CDDP前實(shí)驗(yàn)組大鼠與空白對(duì)照組相似，皮毛光滑，活潑好動(dòng)，每天鼠料消耗量基本恒定，體質(zhì)量均穩(wěn)定增長(zhǎng)。注射CDDP后，模型組大鼠皮毛蓬亂、發(fā)黃、無光澤，鼠料消耗量明顯減少，體質(zhì)量逐漸下降。LBP組大鼠上述現(xiàn)象較模型組減輕。

2.2 LBP對(duì)CDDP所致急性腎損傷大鼠腎臟系數(shù)、血清BUN和Scr含量的影響

表2 LBP和CDDP對(duì)大鼠腎臟系數(shù)、血清BUN和Scr含量的影響(±s，n=50)Table 2 Effect of LBP and cisplatin on kidney coefficient and serum BUN and Scr levels in rats (±s，n=50)

表2 LBP和CDDP對(duì)大鼠腎臟系數(shù)、血清BUN和Scr含量的影響(±s，n=50)Table 2 Effect of LBP and cisplatin on kidney coefficient and serum BUN and Scr levels in rats (±s，n=50)

注：*.與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與空白對(duì)照組相比，有極顯著差異(P＜0.01)；Δ.與CDDP模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；ΔΔ.與CDDP模型組相比，有極顯著差異(P＜0.01)。下同。

組別 腎臟系數(shù) BUN含量/(mmol/L) Scr含量/(mmol/L)空白對(duì)照組 0.84±0.06 8.22±0.77 53.13±7.06 CDDP模型組 1.05±0.10** 71.21±8.88** 323.50±68.17**LBP低劑量組 1.03±0.08** 56.33±11.07** 259.64±78.74**LBP中劑量組 1.08±0.06** 60.05±10.38** 276.85±88.71**LBP高劑量組 1.00±0.08** 55.66±10.31**Δ 267.17±62.60**Δ

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，CDDP模型組大鼠腎臟系數(shù)、血清BUN和Scr含量極顯著升高(P＜0.01)。LBP各劑量組與CDDP模型組相比，高劑量組的血清BUN及Scr含量顯著降低(P＜0.05)，腎臟系數(shù)無顯著性差異性；中、低劑量組大鼠腎臟系數(shù)、血清BUN和Scr含量與CDDP模型組差異均無顯著性。

2.3 LBP對(duì)CDDP所致急性腎損傷大鼠腎皮質(zhì)中NO和MDA含量及SOD、NOS活性的影響

表3 各組大鼠腎皮質(zhì)中NO、MDA含量及SOD和NOS的活性(±s，n=50)Table 3 NO and MDA levels and SOD and NOS activities in renal cortex of rats (±s，n=50)

表3 各組大鼠腎皮質(zhì)中NO、MDA含量及SOD和NOS的活性(±s，n=50)Table 3 NO and MDA levels and SOD and NOS activities in renal cortex of rats (±s，n=50)

組別NO含量/(μmol/g pro)NOS活性/(U/g pro)SOD活性/(U/g pro)MDA含量/(nmol/g pro)空白對(duì)照組 12.30±1.15 2.29±1.04 213.46±13.65 4.95±0.43 CDDP模型組 17.14±2.80** 7.37±1.62** 200.68±27.44 7.05±0.53**LBP低劑量組 14.13±1.61 5.14±1.26**Δ 211.71±18.74 6.22±0.80**ΔΔ LBP中劑量組 13.48±2.08Δ 4.96±1.08**Δ 211.96±17.01 6.12±0.56**ΔΔ LBP高劑量組 13.08±0.93Δ 4.73±1.03**ΔΔ 212.61±17.64 5.99±0.57*ΔΔ

由表3可見，與空白對(duì)照組相比，CDDP致大鼠腎損傷模型組中，NO和MDA含量、NOS活性明顯升高(P＜0.01)。與CDDP模型組相比，LBP各劑量組中MDA含量極顯著性降低(P＜0.01)；LBP高劑量組大鼠NO含量顯著升高(P＜0.05)，NOS活性極顯著升高(P＜0.01)，SOD活性升高，但不具有顯著性差異；LBP中、低劑量組NOS活性顯著降低(P＜0.05)，LBP低劑量組 NO含量、SOD活性均無顯著性差異。

3 討 論

CDDP腎毒性的表現(xiàn)形式多種多樣，包括從可逆的急性腎功能損傷到伴有顯著腎組織學(xué)改變的不可逆的慢性腎功能衰竭。它對(duì)腎臟的不同部位都可損傷，可引起腎小管、腎小球的功能和形態(tài)學(xué)的改變；腎小管，特別是近曲小管和集合管是CDDP腎損傷的主要靶位，發(fā)生腎毒性時(shí)，血清BUN變化最為敏銳，多在用藥后1～3周內(nèi)出現(xiàn)，腎臟病理改變程度與BUN相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：注射CDDP后第5天，模型組大鼠血清BUN、Scr含量較正常對(duì)照組顯著升高，提示7mg/kg CDDP誘發(fā)大鼠明顯的腎損傷。

CDDP精確的腎細(xì)胞毒性機(jī)理仍不明，大量研究[14-15]表明，CDDP所致腎損害與氧化應(yīng)激有關(guān)，表現(xiàn)在CDDP誘發(fā)腎損害的同時(shí)可引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA等)含量增多，抗氧化酶(如SOD等)活性下降。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，組織中 MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映該組織損傷情況。脂質(zhì)是生物膜的主要成分，當(dāng)自由基與活性氧攻擊生物膜時(shí)，對(duì)生物膜易造成過氧化損害，同時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA。生物膜的過氧化損傷會(huì)導(dǎo)致其通透性增加、流動(dòng)性下降、膜蛋白功能異常等變化，影響和破壞生物膜正常的生理功能，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷。

脂質(zhì)過氧化物與CDDP的腎毒性有關(guān)，這個(gè)抗癌藥物的單一劑量已經(jīng)被報(bào)道過[16]。Kruidering等[17]研究表明CDDP的毒性與脂質(zhì)過氧化作用沒有直接的關(guān)系，抗氧化劑也許是通過減少炎癥反應(yīng)和損傷組織中活性氧的釋放來緩解腎毒性。因此，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或許增加了腎臟中活性氧的產(chǎn)生，這將導(dǎo)致廣泛的脂質(zhì)過氧化腎損傷。本研究數(shù)據(jù)顯示給予大鼠7mg/kg CDDP后的第5天，MDA含量明顯升高，表明CDDP誘發(fā)腎皮質(zhì)細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生增加，造成腎組織細(xì)胞損傷。

王黎等[18]提出腎皮質(zhì)SOD與血清Scr、BUN含量呈負(fù)相關(guān)。SOD是人體內(nèi)最重要的自由基清除劑，其活性的降低反映了自由基生成的增多及巰基(－SH)的耗竭。CDDP可誘發(fā)腎臟SOD活性降低，這可能是因?yàn)镃DDP可導(dǎo)致腎臟組織細(xì)胞的Cu、Zn離子丟失，而Cu離子、Zn離子是SOD發(fā)揮作用所需要的金屬離子[19]。或是CDDP直接與SOD活力點(diǎn)巰基基團(tuán)結(jié)合所致[20]，SOD活性的下降使組織不能有效地清除代謝產(chǎn)生的自由基，脂質(zhì)化反應(yīng)增強(qiáng)。也可能是CDDP誘發(fā)產(chǎn)生大量自由基，超出腎組織抗氧化系統(tǒng)的代謝能力后，大量消耗細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物，并攻擊生物大分子，導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷及酶活性的降低[21]。但也有研究表明[22]，CDDP并沒有引起SOD活性下降，反而略有升高，CDDP導(dǎo)致腎臟的抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)代償性的應(yīng)激反應(yīng)。自由基是氧化酶的底物，自由基濃度的升高可正反饋引起其代謝酶活性的增強(qiáng)。因此，SOD活性的升高，預(yù)示著腎組織內(nèi)產(chǎn)生了大量的超氧陰離子自由基和羥自由基。本研究結(jié)果表明，給予大鼠7mg/kg CDDP后的第5天，SOD活性下降，但與空白對(duì)照組沒有顯著性差異。提示CDDP誘發(fā)SOD活性的變化是一個(gè)復(fù)雜的過程，本研究SOD活性與對(duì)照組沒有顯著性差異原因有待進(jìn)一步探討。

大量的研究表明，NO在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與組織損傷過程中起重要作用，Peresleni等[23]證明對(duì)上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激引起NOS產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致NO釋放、亞硝酸鹽產(chǎn)生增加、細(xì)胞的生存能力降低。自由基引起NOS產(chǎn)生的機(jī)制還不清楚，NO的細(xì)胞毒性作用依賴于細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)及產(chǎn)生超氧化亞硝基陰離子(ONOO－)的能力。據(jù)報(bào)道[24]，NO并不直接造成組織損害，而是與超氧化物陰離子(O2－)反應(yīng)生成超氧亞硝基陰離子(ONOO－)，后者可分解產(chǎn)生羥自由基(·OH)而產(chǎn)生毒性。NO與O2－反應(yīng)的速率比SOD清除的速率快得多，所以NO可與SOD競(jìng)爭(zhēng)O2－，與O2－反應(yīng)生成ONOO－。ONOO－還可通過使蛋白中的酪氨酸硝基化，抑制SOD活性[25]，以致經(jīng)SOD清除得極少，而使更多的O2－與NO反應(yīng)，生成大量ONOO－，后者又可繼續(xù)抑制SOD活性，以致形成惡性循環(huán)。體外研究已表明，外源性NO能抑制SOD和過氧化氫酶(CAT)的活性，并引起明顯的脂質(zhì)過氧化形成[26]。目前，NO在環(huán)孢菌素A誘發(fā)急性腎衰中作用的文獻(xiàn)報(bào)道較多[27]，但在CDDP誘發(fā)急性腎衰過程中的研究很少。本研究結(jié)果表明，在注射CDDP后的第5天腎皮質(zhì)NOS與NO的含量明顯高于空白對(duì)照組，推測(cè)NOS的產(chǎn)生可能是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)中自由基引起的。NO S產(chǎn)生增加，引起NO釋放，導(dǎo)致腎臟病理損傷，NOS、NO含量變化與血清BUN、Scr變化完全一致，因此，在CDDP誘發(fā)腎衰過程中，NO起著很重要的作用。

枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)保健良藥，還是營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑(功能食品)，具有滋補(bǔ)肝腎等多方面的藥理作用和生物活性功能[28]。一般認(rèn)為枸杞子的抗氧化作用主要與其所含枸杞多糖等活性成分有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，1008mg/kg LBP組大鼠腎皮質(zhì)NO含量、NOS活性、MDA含量及血清BUN及Scr含量均明顯低于CDDP模型組，277mg/kg LBP和554mg/kg LBP對(duì)CDDP所致腎毒性也有防護(hù)作用，但抗氧化作用不明顯。LBP的抗氧化性呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)表明，1008mg/kg LBP可明顯減輕CDDP誘導(dǎo)的腎損傷，其作用主要是通過抑制NOS活性從而降低腎組織NO含量，減少腎組織氧自由基的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。

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Protective Effect ofLycium barbarumPolysaccharide against Cisplatin-induced Nephrotoxicity in Rats

ZHANG Hai-lian，GAO Li-ping*，LENG Hong-tao，LI Zhen
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biological Active Substance and Functional Food, College of Applied Arts and Technology,Beijing Union University, Beijing 100083, China)

Objective: To reveal the protective effect and possible mechanism ofLycium barbarumpolysaccharide (LBP) against cisplatin (CDDP)-induced nephrotoxicity in rats. Methods: A total of 50 rats were randomly divided into blank control group,CDDP model group, and high-dose, medium-dose and low-dose LBP groups (orally administered at doses of 277, 554, 1008 g/(kg ·d)respectively once daily for 15 days). The blank control and CDDP model groups were both orally administered with distilled water during the adminstrtion period. After 10 days of administration, the blank control group was given normal saline by intraperitoneal injection while a single injection of CDDP in the remaining groups was carried out to establish a mouse model of renal injury.At the end of the administration period, all rats were sacrificed to determine serum BUN and Scr contents as well as NO and MDA contents and NOS and SOD activities in the kidney. Results: In the rats with CDDP-induced nephrotoxicity LBP pretreatment could significantly reduce the increase in serum BUN and Scr levels and kidney MDA and NO levels and NOS activity caused by CDDP (P＜0.05 orP＜0.01). Conclusions: Oral intake of LBP ameliorates CDDP-induced renal dysfunction.The mechanism may be related to the decreased NOS activity and NO and MDA contents.

cisplatin；Lycium barbarumpolysaccharide (LBP)；nephrotoxicity；nitrogen monoxide (NO)；malondialdehyde (MDA)；nitric oxide synthase (NOS)；superoxide dismutase (SOD)

R318.0

A

1002-6630(2012)05-0268-04

2011-04-11

北京市教委科技發(fā)展面上項(xiàng)目(KM200911417004)

張海蓮(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称飞饔?。E-mail：zhl200521502008@126.com

*通信作者：高麗萍(1962—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称飞饔谩-mail：gaolip62@163.com