徐 鑫，蔡麗麗，劉國(guó)艷，何佳易，魏曉蕊，王之穎，張 軍

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2. 揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)，江蘇 揚(yáng)州 225001)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件制備乳源ACE抑制肽

徐 鑫1，蔡麗麗1，劉國(guó)艷1，何佳易1，魏曉蕊1，王之穎1，張 軍2

(1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2. 揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)，江蘇 揚(yáng)州 225001)

采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化胰蛋白酶(PTN6.0S)酶解酪蛋白酸鈉的工藝條件，制備高活性的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽。利用準(zhǔn)確度更高的RP-HPLC法測(cè)定酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考察pH值、溫度、時(shí)間、底物質(zhì)量濃度、酶與底物比等因素對(duì)ACE抑制肽活性的影響。結(jié)果顯示：響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件得到數(shù)學(xué)模型為：抑制率/%＝－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－0.054526A2－0.079754B2－0.53587C2－0.28096D2，確定最佳工藝條件為pH7.0、溫度52.31℃、時(shí)間19.44h、底物質(zhì)量濃度5.91g/100mL、酶與底物比8.37‰，此時(shí)ACE抑制率達(dá)97.11%。關(guān)鍵詞：酪蛋白酸鈉；胰蛋白酶；ACE抑制肽；響應(yīng)曲面法；RP-HPLC

高血壓已在世界范圍內(nèi)成為發(fā)病率最高的慢性疾病之一[1]，也是心血管疾病最主要的誘因[2]，嚴(yán)重危害人體健康。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者從不同食物蛋白酶解產(chǎn)物中相繼發(fā)現(xiàn)具有血壓調(diào)節(jié)功能的安全、無(wú)副作用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽[3-10]。酪蛋白酸鈉是一種富含生物活性肽的蛋白質(zhì)，其蛋白結(jié)構(gòu)與酪蛋白相似且溶解性明顯優(yōu)于后者，它在特異性蛋白酶作用下能釋放出諸如類阿片肽、免疫調(diào)節(jié)活性肽、ACE抑制肽等生物活性肽是酶解的優(yōu)良底物[11-12]。此外，選擇適宜的酶進(jìn)行酶解能夠使產(chǎn)物的生物活性最大化，胰蛋白酶專一性相對(duì)較高，在制備生物活性肽的同時(shí)又可以改善蛋白的消化作用，降低蛋白的致敏性[6]。

本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白酸鈉為原料，經(jīng)胰蛋白酶(PTN6.0S)酶解，采用RP-HPLC法測(cè)定酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，通過單因素及響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件，為ACE抑制肽的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白酸鈉(蛋白含量87%) 新西蘭恒天然公司；胰蛋白酶PTN6.0S(酶活力1.89×104U/g) 丹麥諾維信公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、馬尿酸(HA)美國(guó)Sigma公司；水、甲醇和三氟乙酸(TFA)均為HPLC級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

524型恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦公司； RV 10基本型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司；5804R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Delta320pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Alphal-2 LD Plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A UV/Vis紫外檢測(cè)器 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制多肽樣品制備工藝

酪蛋白酸鈉→雙蒸水溶解→加酶→恒溫酶解→滅酶(沸水浴，10min)→離心(10000r/min，4℃，15min)→取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→冷凍干燥→凍干粉

1.3.2 酶解工藝條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)所用酶的最佳酶解條件以及前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)定固定酶解溫度50℃、時(shí)間8h、底物質(zhì)量濃度3g/100mL、pH7.0，酶與底物比1‰中的4個(gè)因素，改變其中1個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，各因素梯度設(shè)計(jì)為：溫度35、40、45、50、55、60、65℃；時(shí)間3、8、13、18、23、28、33h；底物質(zhì)量濃度1、2、3、4、5、6、7g/100mL；酶與底物比0.1‰、0.2‰、0.4‰、1‰、2‰、4‰、10‰，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.3 酶解工藝條件的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為響應(yīng)值，選取溫度、時(shí)間、底物質(zhì)量濃度、酶與底物比為影響因素，進(jìn)行四因素三水平分析，共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中5個(gè)為中心點(diǎn)，具體設(shè)計(jì)見表1。

表1 酶解工藝條件的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 ACE抑制活性的測(cè)定

將HHL和ACE分別溶于pH8.3的HEPES緩沖液。取10μL的ACE溶液和50μL樣品(0.05g/L)混合置于37℃水浴5min，然后于同一溫度下加入80μL的HHL溶液水浴反應(yīng)30min，最后在混合體系中加入200μL HCl(1mol/L)終止反應(yīng)，樣品經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后進(jìn)樣[13-18]。

色譜條件：Intertsil ODS-SP柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)50%甲醇，其中包含0.1% TFA，流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：228nm；柱溫：25℃；檢測(cè)時(shí)間：20min；進(jìn)樣量：10μL；定量方法：外標(biāo)法。抑制率用下式計(jì)算。

式中：Ec是ACE抑制劑不參加反應(yīng)的條件下測(cè)得的吸光度(空白樣品組)；Es是ACE及ACE抑制劑都存在條件下測(cè)得的吸光度(樣品組)；Eb是ACE不參與反應(yīng)的條件下的吸光度(底物HHL組)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)曲面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素酶解試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對(duì)ACE抑制率的影響

圖1 酶解溫度對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

由圖1可知，50℃時(shí)ACE抑制率最高，偏離此溫度抑制率會(huì)發(fā)生不同程度的降低，這與胰蛋白酶(PTN6.0S)的最適作用溫度相符合。據(jù)此，在響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇50℃為中心溫度。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響

如圖2所示，ACE抑制率在0～8h內(nèi)逐漸上升，8～18h內(nèi)穩(wěn)步下降，18～33h內(nèi)下降速度加快。因此，確定8h為最佳酶解時(shí)間。據(jù)Mullally等[19]報(bào)道，在最初的酶解階段，ACE抑制活性肽能夠被逐步釋放出來(lái)，但是進(jìn)一步降解并不能使ACE抑制活性得到進(jìn)一步的提升。長(zhǎng)時(shí)間的酶解可能會(huì)使ACE抑制肽進(jìn)一步降解，由此減弱了產(chǎn)物的ACE抑制活性。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)ACE抑制率的影響

圖3 底物質(zhì)量濃度對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如圖3所示，底物質(zhì)量濃度在1～4g/100mL范圍內(nèi)，ACE抑制率隨著底物質(zhì)量濃度的增加而上升，之后底物質(zhì)量濃度增加，ACE抑制率逐漸降低。有報(bào)道顯示與此相一致的趨勢(shì)[20-22]，底物質(zhì)量濃度的增加對(duì)酶有抑制作用，即多個(gè)底物分子可能占據(jù)了酶的部分活性位點(diǎn)，使酶不能發(fā)揮很好的效果。據(jù)此，在響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇4g/100mL為中心底物質(zhì)量濃度。

2.1.4 酶與底物比對(duì)ACE抑制率的影響

圖4 酶與底物比對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of ratio of enzyme to substrate on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如圖4所示，酶與底物比也是影響酶解產(chǎn)物ACE抑制率的重要因素，隨著酶量的增加，ACE抑制率上升，酶與底物比在0.1‰～4‰范圍內(nèi)，ACE抑制率上升趨勢(shì)很明顯。據(jù)此，考慮實(shí)驗(yàn)成本等因素，在響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中選擇5.5‰為中心酶與底物比。

2.1.5 pH值對(duì)ACE抑制率的影響

圖5 pH值對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.5 Effect of pH on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如圖5所示，pH值對(duì)酶解產(chǎn)物的ACE抑制率影響較小，而在活性測(cè)定中pH值會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大干擾。綜合考慮后，在響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中，固定pH值為7.0，不考慮pH值的變化對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。

2.1.6 RP-HPLC色譜圖

圖6 標(biāo)準(zhǔn)樣馬尿酸(HA)色譜圖Fig.6 Chromatograms of hippuric acid standard

圖7 空白樣色譜圖Fig.7 Chromatograms of control sample

由圖6可知，馬尿酸(HA)標(biāo)樣出峰時(shí)間在5.150min，圖7所示的空白樣品在相同保留時(shí)間也出峰，通過對(duì)HA峰面積的計(jì)算，可以精確計(jì)算出不同樣品的ACE抑制率。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，根據(jù)回歸模型的顯著性剔除了不顯著交互項(xiàng)AC和CD，分析結(jié)果顯示，模型的F值為15.89，P＜0.01，表明該回歸模型顯著。失擬項(xiàng)的P值為0.174，說明失擬不顯著，該模型有較好的擬合度。根據(jù)回歸系數(shù)，可得二次多項(xiàng)回歸方程：抑制率/%＝－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－0.054526A2－0.079754B2－0.53587C2－0.28096D2?；貧w系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，C項(xiàng)(P＝0.0004)、D、A2、B2、D2項(xiàng)均P＜0.01，均為顯著項(xiàng)。

表2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Test design and results of hydrolysis condition optimization by response surface methods

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與條件優(yōu)化

圖8列出了各因素間交互作用的響應(yīng)曲面圖(CD、AC項(xiàng)不顯著，被剔除)。由曲面的彎曲程度和等高線可以看出，圖8a中，溫度一定時(shí)，ACE抑制率隨時(shí)間先上升后下降，不同溫度條件下，ACE抑制率對(duì)時(shí)間的變化也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；圖8b中，溫度和酶與底物比對(duì)ACE抑制率的影響效果明顯，均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；圖8c中，底物質(zhì)量濃度對(duì)ACE抑制率變化較小，總體較平緩，時(shí)間對(duì)其影響較明顯；圖8d顯示，酶與底物比和時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響效果相近。

圖8 酶與底物比、時(shí)間、溫度、底物質(zhì)量濃度交互影響ACE抑制率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four hydrolysis parameters on ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

模型優(yōu)化的最佳酶解條件為：溫度52.31℃、時(shí)間19.44h、底物質(zhì)量濃度5.91g/100mL、酶與底物比8.37‰，用胰蛋白酶在體系為pH7.0時(shí)酶解酪蛋白酸鈉，多肽產(chǎn)物ACE抑制率為97.11%。

采用優(yōu)化的條件對(duì)酶解酪蛋白酸鈉進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，為方便操作，條件設(shè)為溫度52℃、時(shí)間19h、底物質(zhì)量濃度6g/100mL、酶與底物比8‰、pH7.0，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該條件下得到多肽的ACE抑制率為96.5%，與模型估計(jì)值97.11%相比，相對(duì)誤差為0.628%，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的酶解工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，利用本實(shí)驗(yàn)建立的模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多肽的體外ACE抑制活性與酶解條件并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各因素間的交互作用明顯。胰蛋白酶酶解酪蛋白酸鈉制備ACE抑制肽的最優(yōu)工藝為：pH7.0的體系下，溫度52.31℃、時(shí)間19.44h、底物質(zhì)量濃度5.91g/100mL、酶與底物比8.37‰。此時(shí)，獲得的多肽ACE抑制率最高，達(dá)97.11%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明優(yōu)化出的最佳工藝具有較好的可重現(xiàn)性。

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Response Surface Methodology for Optimization of Hydrolysis Conditions for the Production of Milk-derived Angiotensin-I Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides

XU Xin1，CAI Li-li1，LIU Guo-yan1，HE Jia-yi1，WEI Xiao-rui1，WANG Zhi-ying1，ZHANG Jun2
(1. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；
2. Farm of Experiment, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China)

In our present study, response surface methodology was used to optimize process conditions for the hydrolysis of sodium caseinate by trypsin to prepare highly active angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. ACE inhibitory rate was measured by RP-HPLC. One-factor-at-a-time method followed by response surface analysis was used to analyze the effects of pH, temperature, hydrolysis time, substrate concentration, enzyme/substrate ratio on ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate. A mathematical model describing the relationship of ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate with temperature (A), hydrolysis time (B), substrate concentration (C) and enzyme/substrate ratio (D) was obtained as follows:Y=－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－ 0.054526A2－ 0.079754B2－ 0.53587C2－ 0.28096D2. The optimum hydrolysis conditions were determined as pH 7.0, 52.31 ℃, 19.44 h, substrate concentration of 5.91 g/100 mL and enzyme/substrate ratio of 8.37‰, resulting in an ACE inhibitory rate of 97.11%.

sodium caseinate；trypsin；ACE inhibiting peptides；response surface methodology；RP-HPLC

TS218

A

1002-6630(2012)05-0208-05

2011-04-28

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(08KJD550004)；揚(yáng)州市-揚(yáng)州大學(xué)合作基金項(xiàng)目(YZ2008089)；江蘇省科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項(xiàng)目(BN2008207)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(CXLX11_1017)

徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称焚Y源開發(fā)與利用。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn