張 強，王素英*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

以豆粕為基質(zhì)納豆芽孢桿菌生長條件優(yōu)化

張 強，王素英*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

研究納豆芽孢桿菌在以豆粕為基質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長條件。利用全自動生長曲線測定儀，以菌液濁度OD660nm為指標，對納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源(豆粕)和碳源(葡萄糖)配比進行研究，確定豆粕質(zhì)量濃度50g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度10g/L為最佳配比，并通過單因素及正交試驗篩選出影響納豆芽孢桿菌生長的主要條件。再根據(jù)Box-Behnken試驗優(yōu)化，結(jié)果表明，采用功率80W超聲波處理豆粕4.32min，且培養(yǎng)基初始pH6.16，發(fā)酵溫度35.5℃時納豆芽孢桿菌在發(fā)酵生長13h后達到最大生物量，此時OD660nm為1.635。

納豆芽孢桿菌；豆粕；正交試驗；Box-Behnken試驗

納豆芽孢桿菌是一種從日本納豆中分離出來的益生菌，是枯草芽孢桿菌的一個亞種[1]。研究顯示，大豆蛋白水解物具有ACE抑制活性[2]，而豆粕中富含大量優(yōu)質(zhì)蛋白。利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆粕制備ACE抑制肽，主要是依靠菌種自身的復(fù)合酶系去水解蛋白[3-6]。然而菌種的生理代謝產(chǎn)物必定與其生長狀況息息相關(guān)。為提高納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵生物量，本研究通過正交試驗和Box-Behnken優(yōu)化試驗確定培養(yǎng)基的碳氮源最佳配比、培養(yǎng)基預(yù)處理和液體發(fā)酵的最優(yōu)條件，旨在提高納豆芽孢桿菌水解豆粕生成ACE抑制肽的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)，由本實驗室分離保存。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5、蛋白胨10、氯化鈉5、葡萄糖20、瓊脂粉15，pH7，水1L；種子培養(yǎng)基：配方同斜面培養(yǎng)基，但不加瓊脂粉[7]。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：豆粕50、葡萄糖10、Na2HPO41、NaH2PO41、CaCl20.2、MgSO41，水 1L，pH7。

1.2 材料與儀器

豆粕(蛋白含量為48.74%的脫脂豆粕) 黑龍江廣源糧油加工有限公司。

Bioscreen C全自動生長曲線測定儀 芬蘭Bioscreen公司；ZD-88控溫搖床培養(yǎng)箱 常州菲普儀器設(shè)備廠；YXQ-LS-30SII全自動數(shù)顯高壓滅菌鍋 西安常儀儀器設(shè)備有限公司；AUW220D電子分析天平 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將斜面活化菌種制成濃度為108CFU/mL的菌懸液，并按體積分數(shù)2%接種量接種50mL于250mL三角瓶中，37℃、160r/min培養(yǎng)，每2h測1次菌液濁度(OD660nm)繪制生長曲線，對數(shù)生長期末18h培養(yǎng)物作為種子液進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[8-9]。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

以豆粕作為氮源，設(shè)其質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50、60g/L，以葡萄糖作為碳源，設(shè)其質(zhì)量濃度分別為10、20、30g/L，將不同質(zhì)量濃度的氮源和碳源組合配成不同碳氮比(C/N比)的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)為7，于115℃滅菌20min后，取發(fā)酵培養(yǎng)基300μL，種子發(fā)酵液40μL點到Bioscreen C測定板上。設(shè)定37℃，振蕩幅度Middle，自動測定36h，以納豆芽孢桿菌菌液濁度為指標確定最佳配比[10-13]。

1.3.3 單因素和正交試驗設(shè)計

單因素試驗：利用Bioscreen C自動生長曲線測定儀，在同一多孔培養(yǎng)板上點樣，設(shè)定溫度30℃，振動強度為Middle，自動測定24h，以納豆芽孢桿菌OD660nm值為指標，考察培養(yǎng)基初始pH值、超聲功率[14]、超聲時間、溫度對納豆芽孢桿菌生長的影響。

正交試驗：為了反映各因素對納豆芽孢桿菌生長的綜合影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以納豆芽孢桿菌OD660nm值為指標，進行正交試驗優(yōu)化，因素及水平設(shè)計見表1。

表1 納豆芽孢桿菌生長條件的正交試驗因素水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

1.3.4 Box-Behnken試驗設(shè)計

在正交試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇顯著因素，通過Box-Behnken試驗設(shè)計進一步優(yōu)化，以確定納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵數(shù)學(xué)模型和最優(yōu)生長條件[15]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Minitab統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。利用Origin8軟件繪制數(shù)據(jù)圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳氮比的確定

圖1 不同碳氮比對納豆芽孢菌生長的影響Fig.1 Effects of ratio of carbon and nitrogen source on the growth of Bacillus subtilisnatto

以O(shè)D600nm值為指標，結(jié)果表明在葡萄糖質(zhì)量濃度10g/L，豆粕質(zhì)量濃度50g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，納豆芽孢桿菌的生長狀況最佳，OD660nm值最大可達到1.4。在其他條件中，低質(zhì)量濃度的葡萄糖和低質(zhì)量濃度豆粕組合配制的培養(yǎng)基中納豆菌的生長狀況較好，且基本規(guī)律是葡萄糖質(zhì)量濃度稍高時，豆粕質(zhì)量濃度要相應(yīng)降低，也就是說當碳源和氮源質(zhì)量濃度同時過高時，不利于納豆菌的生長。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 初始pH值的影響

圖2 不同培養(yǎng)基初始pH值對納豆芽孢桿菌生長的影響Fig.2 Effects of initial pH value on the growth of Bacillus subtilisnatto

在超聲時間10min，功率50W，溫度30℃的條件下，考察不同pH值對納豆芽孢桿菌生長的影響，結(jié)果如圖2所示。從生長曲線看，培養(yǎng)基初始pH值為6時，納豆芽孢桿菌的生長最好，幾乎不存在延滯期，且對數(shù)生長期很短，接種10h后菌懸液OD660nm值達到最大值1.2。

2.2.2 超聲波功率的影響

在初始pH6，溫度30℃的條件下，采用30、40、50、60、70、80、90、100W超聲波功率對豆粕培養(yǎng)基進行破碎預(yù)處理，處理時間定為10min，工作1s間隔1s，之后進行納豆芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，以觀察超聲波功率對納豆芽孢桿菌生長的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對納豆芽孢桿菌生長的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the growth of Bacillus subtilisnatto

從圖3可以看出，不同功率超聲波處理豆粕培養(yǎng)基，均能促進納豆芽孢桿菌的生長，并且隨著功率的增加，納豆芽孢桿菌的生長狀況變好，功率達到80W時，菌懸液的OD660nm值最大，達到1.2，之后緩慢下降?？赡苁浅暡ㄌ幚韺?dǎo)致豆粕蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，有利于納豆芽孢桿菌利用。

2.2.3 超聲波預(yù)處理時間的影響

對初始pH6的豆粕培養(yǎng)基進行超聲波預(yù)處理，超聲波預(yù)處理功率80W，將處理時間設(shè)置為3、5、7、10、15min，處理方式為工作1s間隔1s，之后在30℃條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖4。

圖4 預(yù)處理時間對納豆芽孢桿菌生長的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment time on the growth of Bacillus subtilisnatto

由圖4可知，與未進行預(yù)處理的豆粕培養(yǎng)基相比，3min和5min的短時間預(yù)處理，有利于納豆芽孢桿菌的生長，處理7min時與未經(jīng)處理的生長狀況相當，10min和15min的長時間處理則不利于菌的生長，這可能由于短時間處理使得豆粕蛋白變性水解，促進納豆芽孢桿菌的利用，而超聲波處理時間過長，培養(yǎng)基產(chǎn)生大量氣泡，對納豆菌的生長有一定不利影響。

2.2.4 超聲溫度的影響

利用功率80W的超聲裝置對初始pH6的豆粕培養(yǎng)基進行超聲處理3min，之后在Bioscreen C上進行納豆芽孢桿菌最佳生長溫度的選擇。由圖5可知，即使是很小幅度的溫度變化，也會對納豆芽孢桿菌的液體發(fā)酵生長造成較大的影響。在35℃時，該菌生長狀況最佳，其最大OD660nm值是33℃時的1.4倍。在許多研究中認為納豆芽孢桿菌最佳生長溫度為37℃[16-17]，這一差異可能和Bioscreen C運行時的實際溫度比設(shè)定溫度略高有關(guān)。

圖5 溫度對納豆芽孢桿菌生長的影響Fig.5 Effects of incubation temperature on the growth of Bacillus subtilisnatto

2.3 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

從表2可以看出，各因素對納豆芽孢桿菌生長的影響順序依次為D＞C＞B＞A，即pH值＞溫度＞處理時間＞功率，其中pH值、溫度、預(yù)處理時間對納豆芽孢桿菌生長的影響作用較預(yù)處理功率要大。從直觀分析得出，納豆芽孢桿菌在A1B2C1D1條件下生長狀況最佳，經(jīng)3次驗證實驗，該條件下平均OD660nm值為1.59。即最佳工藝條件為預(yù)處理功率為70W、處理時間5min、溫度35℃、pH值為6.0。

2.4 Box-Behnken試驗確定納豆芽孢桿菌生長的最佳條件

為了進一步優(yōu)化納豆芽孢桿菌的生長條件，根據(jù)正交試驗結(jié)果，選擇影響較大的因素進行Box-Behnken試驗設(shè)計(表3)，預(yù)處理功率設(shè)定為80W，利用Bioscreen C設(shè)定每0.5h自動測定1次OD660nm值，取最大值進行比較，結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平表Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

表4 Box-Behnken試驗優(yōu)化結(jié)果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

表5 方差分析表Table 5 ANOVA for the results from Box-Behnken experimental design

由表3、4可見，Box-Behnken試驗結(jié)果得到回歸方程：Y＝1.6333＋0.0088X1＋0.125X2＋0.0288X3－0.1142X12－0.1917X22－0.0442X32－0.175X1X2－0.015X1X3－0.0025X2X3。由表5可見，回歸極其顯著(P＜0.0001)，失擬并不顯著(P＝0.1 3 2)，回歸方程的確定系數(shù)R2=0.9976，表明該模型與實際情況非常擬合。理論上當發(fā)酵溫度為35.50℃，pH6.16，預(yù)處理時間4.32min時，OD660nm達到最大值1.658。經(jīng)過3次驗證實驗，取其平均值為1.635，與預(yù)測結(jié)果基本吻合。

3 結(jié) 論

3.1 以菌懸液OD660nm值為指標，優(yōu)化了納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比，即在基礎(chǔ)無機鹽成分中，葡萄糖質(zhì)量濃度10g/L，豆粕質(zhì)量濃度50g/L，即C/N比例為1:5時，菌懸液濃度達到最大。

3.2 采用單因素和正交試驗，Box-Behnken試驗優(yōu)化，以菌懸液OD660nm值為指標，對豆粕超聲波預(yù)處理功率和時間，培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)溫度進行了優(yōu)化，結(jié)果表明當利用功率80W的超聲波預(yù)處理豆粕培養(yǎng)基4.32min，發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH6.16，溫度35.5℃時，納豆芽孢桿菌生長情況最好，菌懸液OD660nm值達到1.635，比對照組(1.210)提高了35.12%。這與超聲預(yù)處理破碎豆粕細胞，使得細胞內(nèi)營養(yǎng)成分充分溶出益于納豆菌利用有一定關(guān)系。此工藝優(yōu)化對工業(yè)化擴大生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。

[1] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 8版. 北京: 科學(xué)出版社, 1984: 712-735.

[2] CHIANG W D, TSOU M J, TSAI Z Y, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J]. Food Chem, 2006, 98(4): 725-732.

[3] 葉倩. 發(fā)酵豆粕深度酶解生產(chǎn)低分子大豆多肽[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[4] MEISEL H, BOCKELMANN W. Bioactive peptides from milk proteins:proteolytic activation and the functional properties[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1999, 76: 207-213.

[5] ANTONIOS T F, MACGREGOR G A. Angiotensin converting enzyme inhibitors in hypertension: potential problems[J]. J Hypertens, 1995, 13(Suppl 3): 11-16.

[6] RAIA J J, Jr, BARONE J A, BYERLY W G, et al. Angiotensinconverting enzyme inhibitors: a comparative review[J]. DICP, 1990, 24(5): 506-525.

[7] 薄金嶺. 納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 大豆通報,2004(2): 22-23.

[8] 王成濤, 籍保平, 張麗萍. 納豆激酶高活性菌株的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(4): 71-74.

[9] 孫梅, 匡群. 培養(yǎng)條件對納豆芽孢桿菌形成的影響[J]. 飼料工業(yè),2006, 27(8): 19-24.

[10] WU Y F, BAEK H H, GERARD P D, et al. Development of a meat-like process flavoring from soybean-based enzyme-hydrolyzed vegetable protein (E-HVP)[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(7): 1220-1227.

[11] 張麗萍, 滿麗莉, 馬中蘇. 納豆菌高產(chǎn)培養(yǎng)基的成分優(yōu)化[J]. 中國食品學(xué)報, 2008, 8(1): 33-37.

[12] 楊郁, 張麗靖, 天知誠吾. 納豆激酶高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2007, 23(10): 22-25.

[13] 石彥國, 胡春林. 大豆蛋白酶解前預(yù)處理方法比較研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(2): 110-113.

[14] 錢方, 鄧巖, 周晶, 等. 預(yù)處理對大豆蛋白酶解的影響[J]. 飲料工業(yè),1999, 2(6): 33-35.

[15] BRASIL J L, EV R R, MILCHAREK C D, et al. Statistical design of experiments as a tool for optimizing the batch conditions to Cr(Ⅵ)biosorption onAraucaria angustifoliawastes[J]. J Hazard Mater, 2006,133(1/3): 143-153.

[16] 明飛平, 趙培靜. 納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2009, 25(6): 625-629.

[17] 滿麗莉, 向殿軍. 納豆菌培養(yǎng)條件的初步研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊,2008(8): 51-54; 84.

Optimization of Culture Conditions for the Growth ofBacillus subtilisnattoUtilizing Soybean Meal as Nitrogen Source

ZHANG Qiang，WANG Su-ying*
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Cell suspension turbidity (optical density at 660 nm, OD660 nm) was measured using an automated growth curve analyzer to investigate the growth ofBacillus subtilisnattoduring incubation in a liquid culture medium composed of soybean meal as nitrogen source and glucose as carbon source. The optimal concentrations of soybean meal and glucose were found to be 50 g/L and 10 g/L, respectively. Using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method, temperature, pH and time were identify as major factors that influence the growth ofBacillus subtilisnatto. Further, Box-Behnken experimental design was used to optimize the main influencing factors.Bacillus subtilisnattoachieved the highest biomass after 13 h of incubation at initial pH 6.16 and 35.5 ℃ in the presence of soybean meal treated by ultrasonic for 4.32 min, and the cell suspension turbidity was 1.635 under these conditions.

Bacillus subtilisnatto；soybean meal；orthogonal array design；Box-Behnken experimental design

Q939

A

1002-6630(2012)05-0199-04

2011-05-12

天津市科技支撐計劃重點項目(09ZCKFNC00800)

張強(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為微生物資源與開發(fā)應(yīng)用。E-mail：zq13920769130@163.com

*通信作者：王素英(1964—)，女，教授，博士，研究方向為微生物資源與開發(fā)應(yīng)用。E-mail：wsying@tjcu.edu.cn