文庭池，李光榮,2，康冀川,*，康 超,2，雷幫星

(1.貴州大學 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

蛹蟲草液體種制備及發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和蟲草菌素工藝優(yōu)化

文庭池1，李光榮1,2，康冀川1,*，康 超1,2，雷幫星1

(1.貴州大學 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

為獲得蛹蟲草液體種制備和液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和蟲草菌素的最佳工藝，以蛹草擬青霉Peacilomyces militarisBCEC07菌株為菌種，通過對接種量(孢子濃度)的考察，探索不同孢子濃度對蛹蟲草液體母種制作效果的影響；通過單因素和正交試驗，優(yōu)化生產(chǎn)蟲草菌素各營養(yǎng)因子的最佳種類和配比。結(jié)果表明：在1.5×1010孢子數(shù)的接種量時制作的母種最適合用于蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)菌絲體和蟲草菌素；蔗糖、蛋白胨、MgSO4·7H2O、K2HPO4和NAA是最適合的碳源、氮源、無機鹽及生長因子；工藝優(yōu)化后得出蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的最佳配方為30g/L蔗糖、25g/L蛋白胨、1.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O和4.0mg/L NAA；產(chǎn)蟲草菌素的最佳配方為：30g/L蔗糖、25g/L蛋白胨、1.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O和3.0mg/L NAA。優(yōu)化后生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量分別提高了43.00%(達31.60g/L)和31.60%(達645.12mg/L)。為進一步提高蛹蟲草菌絲體及蟲草菌素的單位產(chǎn)量提供參考。

蛹蟲草；液體發(fā)酵；蟲草菌素；生物量；液體種；工藝優(yōu)化

蟲草菌素(cordycepin)是蛹蟲草產(chǎn)生的一種重要次生 代謝產(chǎn)物。Cuningham等首次報道從蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Link.)培養(yǎng)液中分離出核苷抗菌素，后來由Suhadolnik[1]命名為蟲草菌素。蟲草菌素具有廣泛的藥理作用，它的降血脂作用[2]、減肥作用[3]、抗腫瘤和抗癌作用[4-5]是最近研究的熱點和主要方向。在治療急性前B和前T淋巴細胞白血病方面蟲草菌素也由FDA批準進入了臨床研究(1997年11月美國癌癥研究所和OXiGENE (NASDAQ:OXGN)-NCT00003005，2008年7月OncoVista (NASDAQ:OVIT)-NCT00709215)。

目前蟲草菌素的大規(guī)模生產(chǎn)有兩條途徑：化學法和生物法；Aman等[6]報道用化學合成的方法大規(guī)模生產(chǎn)蟲草菌素相當麻煩而且不易純化。從生產(chǎn)工藝和成本考慮，通過生物法來大規(guī)模生產(chǎn)蟲草菌素是目前最佳的選擇。國內(nèi)外對蟲草菌素的研究較多，但多數(shù)都是對發(fā)酵工藝以及藥理作用的研究，且發(fā)酵工藝以菌絲體得率或者子實體得率作為優(yōu)化指標的居多，對菌株的研究和以產(chǎn)蟲草菌素作為優(yōu)化指標的較少。液體培養(yǎng)由于發(fā)酵時間短等優(yōu)點在蟲草菌素的生產(chǎn)上有重要的應(yīng)用價值。

本研究較系統(tǒng)地優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和蟲草菌素的工藝，并首次報道用于液體發(fā)酵的蛹蟲草液體種制備的優(yōu)化方法。為進一步提高蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量及蟲草菌素的單位產(chǎn)量及其工藝放大提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

蛹蟲草(C. militaris)無性型蛹草擬青霉(Paecilomyces militaris) BCEC07菌株，分離自四川省瓦屋山自然保護區(qū)采集的蛹蟲草鮮標本，保存于西南藥用生物資源教育部工程研究中心生物種質(zhì)資源庫。

菌種活化培養(yǎng)基(PDA)：取馬鈴薯200g煮沸過濾取汁、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL、pH值自然；蛹蟲草液體母種培養(yǎng)基：蛋白胨20g、蔗糖20g、MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO41.0g、水1000mL，pH值自然，121℃滅菌30min；蛹蟲草液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨20g、蔗糖20g、MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO41g、水1000mL，pH值自然，121℃滅菌30min。

1.2 試劑與儀器

蟲草菌素標準品 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1100 Series分析型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；JA2003電子天平 上海天平儀器廠；ZK-82A型真空干燥箱 上海實驗儀器總廠；SB2200型超聲波清洗機 上海Branson公司；YX400高壓蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試菌株的活化

將蛹蟲草菌株分別轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于26℃人工氣候箱中培養(yǎng)5d，活化兩次后置于冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 蛹蟲草液體一級種制作方法的考察

為考察蛹蟲草孢子的接種濃度對液體一級種的影響，將BCEC07菌株孢子懸液進行稀釋，在顯微鏡下通過血球計數(shù)板計數(shù)，并制作一系列不同的孢子濃度梯度。然后將蛹蟲草液體種培養(yǎng)基調(diào)到如下孢子濃度：1.5×102、1.5×103、1.5×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108個/mL進行發(fā)酵，每個濃度5個重復。連續(xù)4d觀察不同濃度梯度的孢子接種后液體一級種菌絲球的形態(tài)、大小、數(shù)量及發(fā)酵液的狀態(tài)變化。

1.3.3 蛹蟲草種子液的制備與接種發(fā)酵方法

將BCEC07菌株孢子懸液進行稀釋，然后按3×108個/mL的孢子濃度接入到液體母種培養(yǎng)基(裝液量為50mL/250mL)中，于23℃、150r/min搖床培養(yǎng)4d。再按體積分數(shù)5%接種量將種子液接入發(fā)酵搖瓶(裝液量為50mL/250mL)中，在23℃、150r/min搖床發(fā)酵12d，每組3個重復，數(shù)據(jù)取其平均值。

1.3.4 取樣

將蛹蟲草液體培養(yǎng)物離心獲得菌絲體和上清液，用雙蒸水沖洗菌絲2～3次。得到基本無培養(yǎng)基的菌絲體，將其置于干燥箱中，50℃烘至質(zhì)量恒定，得干菌絲體。菌絲體和發(fā)酵液中蟲草菌素的檢測參照康冀川等[7]方法采用HPLC測定。每個平行取3瓶，數(shù)據(jù)取其3次平均值。

1.3.5 碳源篩選

以蛋白胨20g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、KH2PO41.0g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、乳糖分別作為5種碳源加入，制備培養(yǎng)基，裝液量為50mL/250mL(所有優(yōu)化實驗均同)，再分別以5%的接種量將種子液接入不同的培養(yǎng)基中，pH值自然，23℃、150r/min搖瓶培養(yǎng)12d，分別對比這5種碳源對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響。

1.3.6 氮源篩選

以蔗糖20g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、KH2PO41.0g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對比牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、麩皮、胰蛋白、酪蛋白分別為氮源時對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響。其中，麩皮經(jīng)煮沸水解10min，經(jīng)過濾取濾液加入。

1.3.7 無機鹽篩選

以蛋白胨20g/L、蔗糖20g/L作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2這5種無機鹽以質(zhì)量濃度0.5g/L分別添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，對比不同無機鹽對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響。

1.3.8 生長因子篩選

真菌的生長需要一些少量的有機物質(zhì)，這些物質(zhì)不能從普通的碳源、氮源合成，需要額外少量加入才能促使其良好的生長，這些有機物質(zhì)被稱為生長因子[8]，本試驗考察了植物生長激素NAA、IAA、IBA和VB1、VC對蟲草菌素產(chǎn)量及生物量的影響。

1.3.9 正交試驗優(yōu)化研究

在溫度23℃、初始pH值為自然、接種菌齡4d、接種量5%、搖床轉(zhuǎn)速150r/min、發(fā)酵時間12d的條件下，在液體培養(yǎng)基優(yōu)化得到的最佳碳源、氮源、無機鹽和生長因子單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，進行五因素四水平(L16(45))正交試驗設(shè)計進行考察，具體設(shè)計見表1。發(fā)酵結(jié)果經(jīng)極差和方差分析，找出各培養(yǎng)基成分的最佳濃度和它們對蛹蟲草生物量和產(chǎn)蟲草菌素總產(chǎn)量的影響程度。

表1 L16 (45) 正交試驗設(shè)計Table 1 L16 (45) orthogonal desing

1.3.10 驗證實驗

將正交試驗所獲得的最佳培養(yǎng)工藝條件進一步驗證并放大(裝液量100mL/500mL)，并設(shè)置對照，比較優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基同條件培養(yǎng)下其生物量及蟲草菌素總產(chǎn)量的差異。

1.3.11 數(shù)理統(tǒng)計方法

將實驗數(shù)據(jù)用SPSS進行統(tǒng)計分析，并進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草液體一級種制作方法的優(yōu)化

從表2可以看出，經(jīng)不同孢子濃度接種液體種子培養(yǎng)基后發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌絲球的大小隨孢子濃度的增大而減小，但數(shù)量卻在增多，且發(fā)酵液也逐漸由澄清變得有一定的黏度、較渾濁、散在菌絲增多。結(jié)果顯示孢子濃度1.5×108個/mL時液體種的生長狀況良好。為了尋求最佳的孢子接種量，進一步將濃度擴大，在孢子濃度3.0×108個/mL的接種量時菌絲球顆粒小且均勻，淡黃色，直徑約為1.2mm左右，數(shù)量很多，均勻布滿搖瓶，發(fā)酵液也澄清、透明。從菌絲球的大小、數(shù)量、均勻度、發(fā)酵液的澄清度及能接種的體積等考慮，選擇3.0×108個/mL作為最佳一級種的接種孢子濃度。

2.2 碳源篩選

表3 不同碳源對蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響Table 3 Effect of different carbon sources on mycelial biomass and cordycepin production in liquid fermentation of C. militaris

由表3可知，在5種碳源中，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖都能得到較高的生物量，但只有蔗糖效果最佳，蟲草菌素總產(chǎn)量達到最高，為541.48mg/L。

表2 接種不同孢子濃度對蛹蟲草液體一級種的影響Table 2 Effect of different concentrations of spores on liquid seed of C.militaris

2.3 氮源篩選

從表4可以看出，不同氮源對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響較大。在6種氮源中，蛋白胨能得到最高的生物量(23.13g/L)和蟲草菌素總產(chǎn)量(662.48mg/L)。牛肉膏作為氮源也獲得較高的蟲草菌素總產(chǎn)量，僅次于蛋白胨。麥麩這種天然氮源在發(fā)酵中得到的生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量都很低，這說明天然氮源可能不利于真菌次生代謝產(chǎn)物的積累。而胰蛋白、酵母膏和酪蛋白在發(fā)酵過程中所獲得的蟲草菌素總產(chǎn)量相差不是很大。不同氮源對蟲草菌素總產(chǎn)量的巨大差異說明氮源及合適的量能促進蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)生蟲草菌素。

2.4 無機鹽篩選

表5 不同無機鹽對蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響Table 5 Effect of different mineral sources on mycelial biomass and cordycepin production in liquid fermentation of C.militaris

從表5可以看出，4種無機鹽對生物量的影響不是很大，與空白對照(不添加無機鹽)相比，MgSO4·7H2O和KH2PO4、K2HPO4能同時獲得高產(chǎn)量的蟲草菌素。值得注意的是，CaCl2的添加反而抑制了蟲草菌素的產(chǎn)生。基于K、P、S和Mg作為微生物生長所需的營養(yǎng)元素和蟲草菌素總產(chǎn)量考慮，同時選用MgSO4、KH2PO4作為培養(yǎng)基中的無機鹽組分，保證微生物能更好的生長。

表4 不同氮源對蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響Table 4 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth and cordycepin production in liquid fermentation of C. militaris

2.5 生長因子篩選

表6 不同生長因子對蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響Table 6 Effect of different growth factors on mycelial biomass and cordycepin production in liquid fermentation of C. militaris

從表6可以看出，IAA、IBA和VC都能促進蛹蟲草菌絲體的生長，NAA得到了最高的蟲草菌素總產(chǎn)量(629.22mg/L)，IBA次之，達614.91mg/L，說明適量的NAA能更好地促進蟲草菌素的積累。

2.6 液體培養(yǎng)基的正交試驗結(jié)果

表9 蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草菌素總產(chǎn)量的方差分析結(jié)果Table 9 Variance analysis for the results of cordycepin production in liquid fermentation of C. militaris

從表8、9可以看出，各種營養(yǎng)因子對發(fā)酵所得生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量的影響均不顯著。從表7直觀分析可以看出，培養(yǎng)基的成分對蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)生物量的影響順序為：蔗糖＞蛋白胨＞MgSO4·7H2O＞KH2PO4＞NAA，最優(yōu)水平為A3B4C3D1E4，即30g/L蔗糖、25g/L蛋白胨、1.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O和4.0mg/L NAA。培養(yǎng)基的成分對蛹蟲草產(chǎn)蟲草菌素總產(chǎn)量的影響順序為：MgSO4·7H2O＞蔗糖＞蛋白胨＞NAA＞ KH2PO4，最優(yōu)水平為A3B4C3D1E3，即30g/L蔗糖、25g/L蛋白胨、1.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O和3.0mg/L NAA。在上述優(yōu)化條件下，蛹蟲草生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量都要比正交試驗最高組(第14組)高，優(yōu)化后生物量提高了33.50%；蟲草菌素總產(chǎn)量提高了1.68%。由以上分析可知，蛹蟲草生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量呈正相關(guān)，生物量的大量產(chǎn)生是蟲草菌素積累的基礎(chǔ)。

2.7 驗證實驗結(jié)果

表7 蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量的正交試驗結(jié)果Table 7 Results of L16 (45) orthogonal tests for optimizing the mycelial growth and cordycepin production in liquid fermentation of C. militaris

表10 基礎(chǔ)培養(yǎng)基與優(yōu)化后的培養(yǎng)基驗證結(jié)果比較Table 10 Comparison between basal medium and optimal medium

從表10可知，在驗證實驗中，工藝優(yōu)化后蛹蟲草生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量都要比未優(yōu)化的高得多，優(yōu)化后生物量提高了43.00%；蟲草菌素總產(chǎn)量提高了31.60%。說明優(yōu)化后各種適宜濃度的營養(yǎng)因子能更好的促進生物量和蟲草菌素的生產(chǎn)。

3 討論與結(jié)論

在真菌發(fā)酵過程中，生物量的大量產(chǎn)生是次生代謝積累的基礎(chǔ)。孢子的接種濃度不僅影響到真菌液體一級種的制作效果(比如菌絲球大小、形態(tài)、密度、發(fā)酵液透明度等)，而且還影響到發(fā)酵的最終結(jié)果(如菌絲球狀態(tài)、發(fā)酵液狀態(tài)、生物量、次生代謝產(chǎn)物的積累)。經(jīng)不同孢子濃度進行接種發(fā)酵考察，母種菌絲球的大小隨孢子濃度的增大而減小，但數(shù)量卻在增多，且發(fā)酵液也逐漸由澄清變得有一定的黏度、較渾濁、散在菌絲增多。結(jié)果顯示，在50mL發(fā)酵液中孢子數(shù)為1.5×1010個的接種量時菌絲球顆粒小且均勻，淡黃色，直徑約為1.2mm左右，數(shù)量很多，均勻布滿搖瓶，發(fā)酵液也澄清、透明。此時有效接種體積最大。故此接種濃度最適合用作蛹蟲草液體發(fā)酵母種。這和日本擬青霉P. japonica當散在菌絲最少、菌絲球最緊密細小時發(fā)酵生產(chǎn)多糖產(chǎn)量最高的結(jié)論相似[9]。

Monaghan等[10]報道，當需要的發(fā)酵產(chǎn)物是次生代謝產(chǎn)物時，發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計顯得特別重要。在本研究文中，蛹蟲草BCEC07菌株生長和產(chǎn)蟲草菌素的最佳碳源是蔗糖，這與周洪波[11]、陳晉安[12]等報道的一致，他們報道的最佳培養(yǎng)碳源均為葡萄糖。而汪宇等[13]報道蛹蟲草液體發(fā)酵的最佳碳源為葡萄糖，這和本的結(jié)果不一致，從生產(chǎn)成本來看，顯然蔗糖更廉價，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

氮是有機體的重要組織元素，真菌能利用的氮包括銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有機氮，但是有機氮源比無機氮源能獲得更高的生物量和代謝產(chǎn)物。本實驗在對蛹蟲草液體深層培養(yǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)了無機氮源獲得了較低的生物量和蟲草菌素產(chǎn)量，而優(yōu)化后以25g/L的蛋白胨添加量作為氮源獲得總的蟲草菌素產(chǎn)量達到了645.12mg/L，說明適量的蛋白胨可促進蟲草菌素的產(chǎn)生。陳磊[14]研究結(jié)果與本實驗結(jié)果相似，他們以蛋白胨為培養(yǎng)液中的氮源時蛹蟲草菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量都達到最高，分別為19.54、3.37g/L；而以無機氮為氮源的發(fā)酵液中胞外多糖只有很少的積累，還報道了添加NH4+不僅能夠成倍地增加蟲草素的含量，同時還在一定程度上提高了胞外多糖的產(chǎn)量。

無機鹽在蛹蟲草的生長和蟲草菌素的產(chǎn)生中扮演著重要的角色。Papagianni[15]報道Ca2+的積累能抑制真菌生物多聚物的合成。本實驗的研究證明發(fā)現(xiàn)了所有添加的無機鹽均能提高蟲草菌素的產(chǎn)量，只是Ca2+在添加以后蟲草菌素的增加的量和其他無機鹽相比要少，即影響蟲草菌素的積累。

生長因子具有促進和抑制微生物生長的作用。在本研究中，與對照實驗相比，其蟲草菌素總產(chǎn)量都比未添加生長因子的要高，這說明適量的植物激素和維生素能刺激蛹蟲草菌絲的生長并促進其代謝物的產(chǎn)生，特別是對胞外蟲草菌素的總產(chǎn)量影響最顯著。

對蛹蟲草整個發(fā)酵過程的分析可以看出，液體一級種的菌絲球形態(tài)、大小、均勻度、發(fā)酵液的澄清度對生物量和蟲草菌素的總產(chǎn)量都有很大的影響，更重要的是液體種的制作在蛹蟲草液體發(fā)酵中對其培養(yǎng)基配方的選擇和環(huán)境因子的考察具有不可低估的實用價值，這也對進一步提高蛹蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素和優(yōu)質(zhì)菌絲體的生產(chǎn)效率，提高經(jīng)濟效益有著重要的意義。

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Preparation of Liquid Seed and Optimal Fermentation Conditions for Mycelial Biomass and Cordycepin Production in Submerged Cultivation ofCordyceps militaris

WEN Ting-chi1，LI Guang-rong1,2，KANG Ji-chuan1,*，KANG Chao1,2，LEI Bang-xing1,2
(1. Engineering and Research Center of Southwest Bio-pharmaceutical Resources, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025, China；2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In order to explore the optimal preparation method of liquid seed and fermentation conditions for mycelial biomass and cordycepin production in submerged cultivation ofCordyceps militaris(BCEC07), effect of liquid seed on mycelial growth and cordycepin production by inoculating different concentrations of spores in seed culture was investigated. Single factor tests were used to investigate the effects of medium compositions on mycelial growth and cordycepin production in liquid fermentation ofC. militaris. Among these factors, sucrose, peptone, MgSO4, K2HPO4 and NAA were the most suitable carbon, nitrogen and mineral sources as well as growth factors, respectively. Through orthogonal tests and the analysis of variance, the optimal liquid media was composed of 30 g/L sucrose, 25 g/L peptone, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, 1.5 g/L KH2PO4 and 4.0 mg/L NAA for mycelial growth and 30 g/L sucrose, 25 g/L peptone, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, 1.5 g/L KH2PO4 and 3.0 mg/L NAA for cordycepin production, respectively. This optimal liquid medium culture resulted in the yield of cordycepin up to 645.12 mg/L and the yield of mycelial biomass up to 31.60 g/L in 500 mL shake-flask culture, which revealed the enhancement by 0.316 fold and 0.43 fold compared with the basal medium.

Cordyceps militaris；submerged culture；cordycepin；mycelial growth；liquid seed；optimization

TQ927

A

1002-6630(2012)05-0144-06

2011-04-17

國家自然科學基金面上項目(30870009)；貴州省教育廳自然科學研究項目(黔教科(2009)0129號)；貴州省“十二五”農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計劃項目(黔科合NY字[2011]3054號)

文庭池(1979—)，男，助理研究員，博士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物學。E-mail：tingchiwen@yahoo.com

*通信作者：康冀川(1962—)，男，教授，博士，研究方向為應(yīng)用微生物學與分子生物學。E-mail：jichuank@yahoo.co.uk