張 旭，尚 楠，張 寶，張志剛，尚慶茂,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

抗瓜果腐霉芽孢桿菌優(yōu)良菌株的篩選及生物學(xué)特性

張 旭1，尚 楠1，張 寶1，張志剛2，尚慶茂2,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

為獲得具有高效抗菌活性的芽孢桿菌用于生物防治與果蔬保鮮，從檸檬、葡萄、紅棗、酸奶、腐乳、豆瓣醬、哈爾濱紅腸等26種食品樣品中分離獲得204株芽孢桿菌，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法，初篩得到62株抗瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的菌株，選取其中抑菌效果明顯的4株菌株，采用牛津杯擴(kuò)散法經(jīng)復(fù)篩得到1株顯著抗瓜果腐霉的芽孢桿菌L-NM62，其發(fā)酵上清液對(duì)瓜果腐霉的抑菌圈直徑達(dá)到(24.54±0.13)mm。菌株L-NM62經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析，被鑒定為枯草芽孢桿菌L-NM62(Bacillus subtilisL-NM62)。進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌L-NM62的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)該菌株的最適生長(zhǎng)溫度37℃，最適pH值7.5，最適接種量1.0%，并測(cè)定了該條件下枯草芽孢桿菌L-NM62的生長(zhǎng)曲線。在此基礎(chǔ)上，考察枯草芽孢桿菌L-NM62的抗菌譜，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌L-NM62具有廣譜的抗菌活性，尤其對(duì)霉菌具有高效廣譜的抗菌效果，顯示出了很好的潛在開發(fā)應(yīng)用前景。

枯草芽孢桿菌；瓜果腐霉；篩選；抑菌；生物學(xué)特性

瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)是重要的植物病原真菌之一，能引起各類農(nóng)作物腐爛、猝倒等癥狀，在苗期發(fā)病尤為嚴(yán)重，常造成大量死苗。瓜果腐霉可通過(guò)其游動(dòng)孢子對(duì)采后果蔬產(chǎn)生毒害作用[1]，導(dǎo)致果實(shí)腐敗。在貯藏期間，其菌絲可以通過(guò)病果和健康果實(shí)接觸而傳染，病菌侵入果皮后，在運(yùn)輸、貯存的過(guò)程中，遇到合適條件時(shí)，就通過(guò)水果的傷口侵入果肉，最終導(dǎo)致果實(shí)腐爛潰敗，失去使用價(jià)值[2]。在防治采后果蔬腐敗的問(wèn)題上，化學(xué)農(nóng)藥應(yīng)用歷史最為悠久，且效果明顯應(yīng)用廣泛。但由于化學(xué)保鮮劑、防腐劑在應(yīng)用過(guò)程中，常引起環(huán)境污染、殘留量較高[3-5]等安全性問(wèn)題，因而開發(fā)高效、廣譜、天然的生物抗菌劑受到廣泛關(guān)注。天然抗菌劑的來(lái)源主要是從植物、動(dòng)物和微生物資源中獲取[6]。

生物控制中的微生物稱為生防微生物[7-8]，微生物相對(duì)于植物和動(dòng)物，具有生長(zhǎng)周期短、代謝產(chǎn)物量大、不受季節(jié)限制的特點(diǎn)，因而成為生物殺菌劑的研究重點(diǎn)。其中芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)研究相對(duì)較多，芽孢桿菌具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，抗逆性強(qiáng)，可以同時(shí)產(chǎn)生一種或多種抑菌物質(zhì)，抑菌譜廣泛和抑菌效果好的特點(diǎn)[9]。近年來(lái)芽孢桿菌的生防作用在國(guó)內(nèi)外得到普遍認(rèn)可，在控制柑橘瓜果腐霉病、綠霉病、蒂腐病[10-11]及櫻桃褐腐病等果蔬病害中得到廣泛應(yīng)用。因此，尋找來(lái)源廣泛、高效安全、抑菌譜廣的芽孢桿菌，在開發(fā)安全、高效、環(huán)保的生物防腐保鮮劑中十分重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法初篩，牛津杯礦散法復(fù)篩，篩選出1株對(duì)瓜果腐霉有拮抗作用的芽孢桿菌，并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行研究，以便其更好地應(yīng)用于生物防治領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與培養(yǎng)基

樣品(市售)：酸奶、紅糖、芒果、魚豆腐、小米、茉莉花茶、紅棗干、奶粉、油炸蝦、海帶、咸鴨蛋、普洱茶、蜂王漿、水果糖、葡萄渣、米酒、炒栗子、豆腐乳、醬油、檸檬、柚子、豆瓣醬、榨菜、龍眼、白菜、哈爾濱紅腸。

菌種：L-NM62菌株為本實(shí)驗(yàn)分離篩選獲得；瓜果腐霉ACCC37383(Pythium aphanidermatumACCC37383)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉AS3.2915 (Aspergillus nigerAS3.2915)、總狀毛霉AS3.4941(Mucor racemosusAS3.4941)、黑根霉AS3.4997(Rhizopus nigricansAS3.4997)、白地霉AS2.1062(Geotrichum candidumAS2.1062)、赭曲霉AS3.3931(Aspergillus ochraceusAS3.3931)、赤散囊菌AS3.3551(Eurotium rubrumAS3.3551) 中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏中心；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、鏈球菌(Streptococcus)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、大腸桿菌(E. coli)、白色念珠菌(Monilia albican)、單增李斯特氏菌1/2a (Listeria monocytogenes1/2a)、單增李斯特氏菌4b (Listeria monocytogenes4b)、灰霉(Botrytis cinerea)本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

PCR反應(yīng)用各種試劑 上海英駿生物技術(shù)有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9802型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺(tái) 北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TC512型PCR儀 美國(guó)Barloworld Scientific公司；TH500梯度混合器 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離

取1g樣品用無(wú)菌研缽研碎并加入到9mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩，80℃水浴15min，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培養(yǎng)24～72h，挑取單菌落劃線純化。對(duì)已純化菌株革蘭氏染色后鏡檢，確認(rèn)產(chǎn)生芽孢后保存待用[9]。

1.3.2 抗瓜果腐霉芽孢桿菌的篩選

瓜果腐霉的培養(yǎng)：將瓜果腐霉接入PDA平板，28℃培養(yǎng)3～4d，直到菌絲布滿整個(gè)平板，4℃保存待用。

抗瓜果腐霉芽孢桿菌優(yōu)良菌株的初篩：將熔化的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，從平板中心出發(fā)畫十字形，PDA平板的中央掐塊接入瓜果腐霉菌餅(直徑5mm)，距菌餅中心25mm處點(diǎn)種芽孢桿菌菌株，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)8h后，28℃培養(yǎng)3d，觀察芽孢桿菌菌落周圍是否存在抑菌圈并用十字測(cè)量法測(cè)量芽孢桿菌菌落直徑及其產(chǎn)生的抑菌圈直徑[12]。

抗瓜果腐霉芽孢桿菌優(yōu)良菌株的復(fù)篩：將初篩出的抗菌效果好的芽孢桿菌菌株，接種于裝有30mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于恒溫振蕩器中，28℃、140r/min培養(yǎng)48h。發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心15min取得上清液，測(cè)定該發(fā)酵上清液的抗菌活性。

發(fā)酵液抗菌活性的測(cè)定：采用杯碟法，用雙層平板。底層：在無(wú)菌平皿中加入5mL PDA培養(yǎng)基，靜置冷卻凝固。上層：將PDA培養(yǎng)基分裝成15mL/管滅菌，熔化后倒入無(wú)菌平皿中，待培養(yǎng)基凝固后，瓜果腐霉菌餅(直徑5mm)掐塊接于培養(yǎng)皿中心，從平板中心出發(fā)畫十字形，距菌餅中心25mm放置牛津杯。每個(gè)牛津杯中加入100μL無(wú)菌濾液及1%的氯霉素20μL，超凈工作臺(tái)中放置30min左右吹干，28℃培養(yǎng)72h后十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，以未接種的培養(yǎng)基上清液作為空白對(duì)照，每次處理3個(gè)重復(fù)[13]。

1.3.3 目標(biāo)菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：挑取少量目標(biāo)菌株在LB平板上劃線，28℃培養(yǎng)20h后觀察單菌落形態(tài)并鏡檢。繼續(xù)培養(yǎng)至24h后進(jìn)行芽孢染色并鏡檢。

生理生化鑒定：主要包括接觸酶實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、海藻酸鈉降解、檸檬酸鹽利用、Tween-80降解、明膠水解、酵母細(xì)胞溶解、卵磷脂降解、耐鹽性、酪氨酸水解、丙酸利用、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇等實(shí)驗(yàn)。

16S rDNA鑒定：用于PCR擴(kuò)增的引物為通用引物，正向引物16Sf：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物16Sr：5＇-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇。PCR反應(yīng)體系(25μL)為：10×Buffer 2.5μL、10mmol/L dNTP 2.0μL、10μmol/L引物各2.5μL、Taq酶0.25μL、模板1.0μL、ddH2O 14.25μL，空白不加模板。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性5min；94℃變性30s、54℃引物復(fù)性1min、72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。所得PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行檢測(cè)后送至北京市擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所得序列利用BLAST程序在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選取相似性較高菌株的16S rDNA序列，用MEGA 3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株L-NM62生理特性的研究

最適生長(zhǎng)溫度確定：將目標(biāo)菌株L-NM62，接種至含50mL LB培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，輕輕振蕩，使菌體分布均勻，置于不同發(fā)酵溫度(20、24、28、32、37、42、45℃)，140r/min搖床培養(yǎng)24h，離心收集上清液，測(cè)600nm波長(zhǎng)處的OD值。

最適pH值測(cè)定：將目標(biāo)菌株L-NM62，分別接種至含不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)LB液體培養(yǎng)基中，在最適生長(zhǎng)溫度140r/min搖床培養(yǎng)24h，取上清液測(cè)OD值。

最適接種量的確定：目標(biāo)菌株采用不同接種量(0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%、3.00%、4.00%)，在最適生長(zhǎng)溫度和pH值條件下，140r/min搖床培養(yǎng)24h，取上清液測(cè)600nm波長(zhǎng)處的OD值。

最適條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將目標(biāo)菌株L-NM62采用最適生長(zhǎng)溫度、pH值及接種量至含50mL LB培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，置于140r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣，以未接種的液體培養(yǎng)基作對(duì)照，測(cè)定OD600nm值和發(fā)酵液pH值，然后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值及pH值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

抗菌譜的測(cè)定：采用傾注平板法接入各種受試的細(xì)菌，然后將芽孢桿菌菌株點(diǎn)種在平板表面，37℃培養(yǎng)，觀察芽孢桿菌菌落周圍是否存在抑菌圈，并采用十字測(cè)量法測(cè)量芽孢桿菌菌落直徑及其產(chǎn)生的抑菌圈直徑。將熔化的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，從平板中心出發(fā)畫十字形，PDA平板的中央掐塊接入受試的各種霉菌菌餅(直徑5mm)，距菌餅中心25mm處點(diǎn)種芽孢桿菌株，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)3d，觀察拮抗作用是否存在并測(cè)量菌落大小。由于霉菌菌絲生長(zhǎng)使抑菌圈形狀不規(guī)則，因此使用抑菌率衡量抑菌效果。以單獨(dú)接種各細(xì)菌、霉菌的平板作為對(duì)照。每處理3次重復(fù)。按下式計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離、篩選

采用稀釋傾注法從26種不同食品樣品中分離獲得204株芽孢桿菌，并分別進(jìn)行斜面保藏和沙土管保藏。通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法，從分離的204株芽孢桿菌，初篩出62株有清晰透明圈形成的芽孢桿菌。通過(guò)計(jì)算抑菌圈直徑與芽孢桿菌菌落直徑的比值來(lái)確定抑菌效果，結(jié)果獲得14株抑菌效果顯著的菌株見表1，部分初篩效果見圖1。

圖1 部分芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的抑菌結(jié)果Fig.1 Inhibitory zone of part of anti-fungal Bacillus spp. to P. aphanidermatum

表1 初篩中有拮抗效果的菌株Table 1 Bacillus spp. with high antifungal activity to P. aphanidermatum by the first screening

將初篩得到的抑菌效果明顯的4株菌株(L-24、L-61、L-62、L-69)進(jìn)行液體培養(yǎng)，離心取其上清液，采用牛津杯法測(cè)其發(fā)酵離心上清液的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)4株芽孢桿菌發(fā)酵液都有抑菌圈產(chǎn)生，L-61、L-69的抑菌效果較差，抑菌圈直徑分別為(15.34±0.32)mm、(21.59±0.22)mm，L-24抑菌圈直徑為(22.04±0.29)mm，L-62抑菌效果明顯，抑菌圈直徑達(dá)到(24.54±0.13)mm，因此確定其為目標(biāo)菌株，并命名為L(zhǎng)-NM62。

2.2 目標(biāo)菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

圖2 菌株L-NM62菌落形態(tài)圖(10×100)Fig.2 The morphological characteristic of L-NM62(10×100)

圖3 菌株L-NM62菌體形態(tài)圖Fig.3 The colony characteristic of L-NM62

菌株L-NM62在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)不規(guī)則，近圓，菌落表面褶皺，邊緣波狀，不透明，濕黏(圖2)。顯微鏡下菌株L-NM62呈短桿狀，芽孢形狀為橢圓形，膨大，近端生(圖3)。

2.2.2 菌株L-NM62的生理生化鑒定

表2 菌株L-NM62的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of L-NM62

從表2可以看出，該菌株接觸酶反應(yīng)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、明膠水解、卵磷脂水解成陽(yáng)性，能夠利用葡萄糖、淀粉，不能在10% NaCl溶液中生長(zhǎng)但能夠在7% NaCl溶液中生長(zhǎng)，初步將菌株L-NM62鑒定為枯草芽孢桿菌[14]。

2.2.3 16S rDNA 同源性的鑒定

進(jìn)一步采用分子生物學(xué)手段對(duì)L-NM62菌株進(jìn)行鑒定，其染色體DNA用PCR擴(kuò)增出單一條帶，PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)DNA測(cè)序后與GenBank上序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株L-NM62與枯草芽孢桿菌同源性最高，達(dá)95%。使用MEGA 3.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)發(fā)現(xiàn)，菌株L-NM62與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)處于同一發(fā)育水平上。

圖4 菌株L-NM62的16S rDNAFig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain L-NM62

根據(jù)表型、生理生化以及16S rDNA鑒定結(jié)果，可以判定菌株L-NM62為枯草芽孢桿菌，并將其命名為枯草芽孢桿菌L-NM62(Bacillus subtilisL-NM62)。

2.3 菌株L-NM62的生理特性研究

2.3.1 最適生長(zhǎng)溫度的確定

由圖5可見，Bacillus subtilisL-NM62菌株在20～37℃之間，隨溫度的升高OD值逐漸增大，37℃達(dá)到最大，超過(guò)37℃，Bacillus subtilisL-NM62菌株OD值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，最終確定其最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

2.3.2 最適生長(zhǎng)pH值的確定

在37℃測(cè)定不同pH值條件下Bacillus subtilisL-NM62生長(zhǎng)的OD值，結(jié)果見圖6。pH值為7.5時(shí)OD值達(dá)到最大，故將pH值為7.5確定為該菌體的最適生長(zhǎng)pH值。2.3.3 最適接種量的確定

圖7 最適接種量的確定Fig.7 Identification of optimal inoculums concentration

在菌株最適生長(zhǎng)溫度37℃，起始pH7.5的條件下，測(cè)定Bacillus subtilisL-NM62在不同接種量下生長(zhǎng)的OD值，結(jié)果見圖7。Bacillus subtilisL-NM62菌株在0.05%～0.50%之間，隨著接種量的增大OD值增大，在接種量1.00%處達(dá)到最大，故將1.00%作為最適接種量，超過(guò)最適接種量，菌株OD值隨著接種量的增大而減小。

2.3.4 最適生長(zhǎng)條件下目標(biāo)菌株的生長(zhǎng)曲線

圖8 最適條件下枯草芽孢桿菌L-NM62的生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curve of L-NM62 under the optimal conditions

由圖8可知，Bacillus subtilisL-NM62在0～8h生長(zhǎng)緩慢，隨后迅速生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20h后生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)到達(dá)穩(wěn)定期。同時(shí)也可以看出，該菌株穩(wěn)定期較長(zhǎng)。Bacillus subtilisL-NM62在培養(yǎng)過(guò)程中，pH值基本穩(wěn)定，由于胺類物質(zhì)的分解造成，pH值略有上升趨勢(shì)。

2.3.5 抗菌譜的測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)一步考察Bacillus subtilisL-NM62對(duì)15株常見有害細(xì)菌與真菌的抗菌效果，結(jié)果如表3所示。

從表3可以明顯看出，Bacillus subtilisL-NM62表現(xiàn)出了廣譜的抗菌活性，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌、假單胞菌等細(xì)菌具有一定的抑制作用，而且對(duì)真菌尤其是病原霉菌表現(xiàn)出了高效的抗菌效果，顯示出了很好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

表3 Bacillus subtilis L-NM62的抗菌譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The antibacterial and anti-fungal spectrum of Bacillus subtilis L-NM62

3 討 論

芽孢桿菌是一群好氧或兼性厭氧、產(chǎn)芽孢的G＋桿菌的總稱[15]。其典型特點(diǎn)是能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，因而有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活與繁殖。國(guó)外關(guān)于芽孢桿菌對(duì)植物病害的防治已做了大量工作，很多菌株已成功用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。如芽孢桿菌QST713、GBO3、MBI600、FZB24等菌株作為生防菌已得到了美國(guó)國(guó)家壞境保護(hù)局(Environmental Protenction Agenay，EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用的許可。其中應(yīng)用最廣泛的是枯草芽孢桿菌[16-19]、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及臘狀芽孢桿菌等。

已有研究[12]表明，枯芽孢桿菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌。芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的途徑分為核糖體和非核糖體合成兩種。核糖體途徑產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)包括細(xì)菌素與類細(xì)菌素、酶類和活性蛋白3類；非核糖體途徑產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)包括脂肽和多肽兩大類，其中脂肽又包括Surfactin、Iturin和Fengycin 3類[13,20]。本研究分離獲得的枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)究竟是屬于哪類物質(zhì)還需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)室將在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展Bacillus subtilisL-NM62所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的分離純化，確定其抗菌類型，研究其理化與應(yīng)用特性，分析其空間結(jié)構(gòu)，探討其抗菌機(jī)理，為該菌株及其所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的應(yīng)用提供理論依據(jù)及前期工作積累。

本實(shí)驗(yàn)選擇多種食品作為原料來(lái)篩選抗瓜果腐霉的優(yōu)良芽孢桿菌，主要是考慮到存在于高滲及干燥食品中篩選出芽孢桿菌的概率較大，且芽孢桿菌可能脅迫不良環(huán)境的能力更強(qiáng)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)初篩后的芽孢桿菌有62株對(duì)瓜果腐霉顯現(xiàn)出了明顯的拮抗作用，而經(jīng)復(fù)篩后確定的目標(biāo)菌株L-NM62，其菌體細(xì)胞及發(fā)酵上清液均對(duì)瓜果腐霉表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抑制效果。同時(shí)通過(guò)對(duì)目標(biāo)菌株生物學(xué)特性研究還發(fā)現(xiàn)，該菌有較為廣譜的抗菌活性，不僅對(duì)常見的食品腐敗細(xì)菌有抑制作用，尤其是對(duì)真菌中的黑根霉、總狀毛霉、白地霉、赤散囊菌、灰霉等均有顯著的抑菌效果，顯示出了很好的潛在價(jià)值和應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)所篩選出來(lái)的目標(biāo)菌株L-NM62其發(fā)酵上清液對(duì)瓜果腐霉具有高效的抑制作用，同時(shí)具有較廣抗菌范圍，尤其表現(xiàn)出對(duì)一些真菌有較為強(qiáng)烈的抑制作用，因而，在今后使用目標(biāo)菌株L-NM62進(jìn)行生物防治的過(guò)程中可以同時(shí)對(duì)多種致病菌產(chǎn)生抑菌效果，增加其應(yīng)用空間及開發(fā)價(jià)值。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從26個(gè)食品樣品中分離獲得204株芽孢桿菌，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法初篩、牛津杯擴(kuò)散法復(fù)篩，最終篩選出一株芽孢桿菌L-NM62，其發(fā)酵上清液對(duì)瓜果腐霉的抑菌圈直徑達(dá)到(24.54±0.13)mm，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)測(cè)定及16S rDNA 序列分析，最終將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌L-NM62(Bacillus subtilisL-NM62)。通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus subtilisL-NM62最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.5，最適接種量為1%，且該菌表現(xiàn)出了廣譜的抗菌活性，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌、假單胞菌等細(xì)菌具有一定的抑制作用，而且對(duì)真菌尤其是病原霉菌表現(xiàn)出了高效的抗菌效果，具有很好的開發(fā)與應(yīng)用潛力。

[1] 賀水山, 張炳欣, 葛起新. 瓜果腐霉游動(dòng)孢子對(duì)番茄和秋海棠侵染過(guò)程的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1992, 20(2): 145-148.

[2] 潘金菊, 于婷. 生防菌BMP-11對(duì)瓜果腐霉病菌的抑制活性及其鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué), 2008, 35(4): 311-316.

[3] DEKKER J, GEORGOPOULOS S G. Fungicide agricultural publishing and documentation resistance in crop protection[J]. Transactions of the British Mycological Society, 1983, 81(1): 188-191.

[4] GEORGOPOULOS S G, SKYLAKAKIS G. Genetic variability in the fungi and the problem of fungicide resistance[J]. Crop Protection, 1986, 5(5): 299-305.

[5] LATORRE B A, SPADARO I, RIOJA M E. Occurrence of resistant strains ofBotrytis cinereato anilinopyrimidine fungicides in table grapes in Chile[J]. Crop Protection, 2002, 21(10): 957-961.

[6] 夏金蘭, 王春. 抗菌劑及其抗菌機(jī)理[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2004, 35(1): 31-38.

[7] 肖春宏. 微生物源抗真菌農(nóng)用抗生素的研究進(jìn)展[J]. 科技信息: 學(xué)術(shù)版, 2008(19): 73-74.

[8] 余鳳玉, 李振華, 曾會(huì)才. 抗真菌農(nóng)用抗生素的研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 25(1): 60-65.

[9] 黃繼翔. 抑?jǐn)U展青霉芽孢桿菌的篩選鑒定及抑菌物質(zhì)研究[D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[10] 黃曦, 許蘭蘭, 黃榮韶. 枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2010(1): 24-29.

[11] ABRAHA O, ABRAHAM M D. Isolation andin vivoscreening of yeast andBacillus antagonistsfor the control ofPenicillium digitatumof citrus fruit[J]. Biological Control, 2010, 53(1): 32-38.

[12] 齊東梅. 藥食源芽孢桿菌的分類鑒定及枯草芽孢桿菌H110抑菌特性研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[13] 趙一楠. 抗青霉芽孢桿菌的篩選及其抑菌物質(zhì)的特性研究[D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[14] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001: 67-69.

[15] 張中義. 植物病原真菌學(xué)[M]. 四川: 四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1988: 71-73.

[16] 程洪斌, 劉嘵橋, 陳紅漫. 枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進(jìn)展[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 22(1): 109-112.

[17] CELIA M, SONIA S F. Optimisation of physical factors on the production of active metabolites byBacillus subtilis355 against wood surface contaminant fungi[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2005, 55(4): 261-269.

[18] WICHITRA L, PUNPEN H. Growth inhibitory properties ofBacillus subtilisstrains and their metabolites against the green mold pathogen (Penicillium digitatumSacc.) of citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2008, 48(1): 113-121.

[19] BESRAT T D, LISE K.Bacillus subtilisattachment, colonization, and survival on avocado flowers and its mode of action on stem-end rot pathogens[J]. Biological Control, 2006, 37(1): 68-74.

[20] 吳艷, 閆豫君, 趙思峰. 組合芽孢桿菌抑菌物質(zhì)特性及其抑菌效果研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 16(5): 266-270.

Screening and Biological Characteristics ofBacillussp. with High Anti-fungal activity againstPythium aphanidermatum

ZHANG Xu1，SHANG Nan1，ZHANG Bao1，ZHANG Zhi-gang2，SHANG Qing-mao2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China) 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, China)

Pythium aphanidermatumis known as an important plant pathogenic fungus that can cause various types of crops rot and damping off, as well as results in spoilage of fruits and vegetables, thus leading to great loss of agricultural production and food industry. In order to obtain spore-forming bacteria with anti-fungal activity for fruit and vegetable preservation and biological control, we have screened 204 strains of spore-forming bacteria isolated from 26 kinds of foods, such as lemon, grape, Chinese date, yogurt, fermented bean curd, Harbin sausage, bean paste and other food samples. Totally 62 strains of sporeforming bacteria were assessed by confrontation culture tests to reveal strong anti-fungal activity againstP.aphanidermatum. The fermentation supernatants of 4 strains with stronger anti-fungal activity through Oxford cup plate assay method were tested for their anti-fungal activity, and L-NM62 revealed the strongest anti-fungal activity againstP.aphanidermatum. The inhibition zone of cell free supernatant was (24.54 ± 0.13) mm in diameter. According to the characteristics of morphology, physiology and biochemistry tests, and the comparison of 16S rDNA sequence, strain L-NM62 was identified asBacillus subtilis. Further study of L-NM62 on physiology characteristics showed that the optimal growth temperature, pH and inoculums were 37 ℃, 7.5 and 1.0%. Under these optimal conditions, L-NM62 had a wide anti-fungal and antibacterial activity and presented a potential prospect.

Bacillus subtilis；Pythium aphanidermatum；screening；anti-fungal activity；biological characteristics

Q936

A

1002-6630(2012)05-0138-06

2011-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172001)；北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目

張旭(1990—)，女，本科生，主要從事益生菌研究。E-mail：hangxu19901218@163.com

*通信作者：尚慶茂(1965—)，男，研究員，博士，主要從事蔬菜工廠化育苗技術(shù)研究。E-mail：shangqm08@yahoo.com.cn