張彥濤，生吉萍,2，葛 佳，矯玉翠，王正榮，程凡升，申 琳,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872)

旱生植物內(nèi)生細(xì)菌的分離及耐旱菌株的篩選鑒定

張彥濤1，生吉萍1,2，葛 佳1，矯玉翠1，王正榮1，程凡升1，申 琳1,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872)

為篩選耐旱內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，以典型耐旱植物為材料，分離純化出142株內(nèi)生細(xì)菌。采用液體培養(yǎng)基中添加聚乙二醇6000降低滲透勢(shì)的方法分析內(nèi)生細(xì)菌的耐旱情況。從中篩選出1株能夠耐受質(zhì)量濃度為60g/100mL聚乙二醇6000的內(nèi)生細(xì)菌PB14。對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化和16S rDNA序列鑒定，判定菌株P(guān)B14為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

耐旱；內(nèi)生細(xì)菌；鑒定；蠟樣芽孢桿菌

植物內(nèi)生菌(endophyte)是指在其生活史的一部分或其整個(gè)生活史，生活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病癥的微生物，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌等[1]。植物內(nèi)生細(xì)菌幾乎存在于所有植物體內(nèi)，而且同一植物體內(nèi)往往含有多種內(nèi)生細(xì)菌，其多樣性極其廣泛。到目前為止，已經(jīng)分離鑒定的內(nèi)生細(xì)菌已達(dá)50多個(gè)屬[2]，植物內(nèi)生菌成為我國(guó)當(dāng)前微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3]。植物內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)并與植物協(xié)同進(jìn)化。一方面，植物體為其提供生長(zhǎng)必需的能量和營(yíng)養(yǎng)；另一方面，內(nèi)生細(xì)菌又可通過(guò)自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響。植物內(nèi)生細(xì)菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，其存在對(duì)加強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性具有重要的意義[4-5]。

“民以食為天”，隨著全球性的氣候異常和生態(tài)平衡的破壞，土地日趨沙漠化，水資源短缺成為全人類(lèi)面臨的嚴(yán)重生態(tài)問(wèn)題，干旱已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，作物耐旱性的研究顯得尤為重要。近年來(lái)，對(duì)于耐旱作物的研究已經(jīng)取得一定的成效，主要包括雜交育種[6]、基因工程[7]等手段。由于雜交育種所需時(shí)間長(zhǎng)，基因工程的安全性等問(wèn)題，利用優(yōu)良耐旱微生物來(lái)提高植物的抗旱能力越來(lái)越受到人們的關(guān)注。動(dòng)植物是食品加工的基本原料，植物耐旱性能的提高可擴(kuò)大植物的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)原料新品種的開(kāi)發(fā)與增產(chǎn)，既豐富了食品原料的多樣性，又改善和提高了食品資源的品質(zhì)特性等[8]。本研究從典型耐旱植物中篩選能夠耐受質(zhì)量濃度為60g/100mL聚乙二醇6000 (PEG6000)的內(nèi)生細(xì)菌，并通過(guò)常規(guī)方法和分子生物學(xué)的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，以豐富耐旱微生物資源，提高作物耐旱性能，為食品資源的改造提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

白蠟、茅草、射干、羅布麻、蓼草、胡楊、怪柳采自山東省東營(yíng)市永安機(jī)場(chǎng)；大蕓、梭梭、沙果、紅柳、核桃采自新疆和田；蓮子采自山東青島。

75%乙醇消毒液 德州安捷高科消毒制品有限公司；次氯酸鈉溶液(有效氯含量≥8%)、聚乙二醇6000 (PEG6000) 西隴化工股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；API50CHB碳水化合物鑒定試劑條 法國(guó)生物梅里埃公司。

分離培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂粉15～20g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4；篩選培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4，PEG6000根據(jù)需要添加；API50CHB培養(yǎng)基 法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-6C瓊脂糖核酸電泳 北京六一儀器廠；GL212全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Kodak公司；PB-10酸度計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化和保藏

采用組織研磨法對(duì)典型旱生植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離[9]。取采集的新鮮樣品，用蒸餾水將植物表面洗凈，稍干后分別取其根、莖、葉，在75%乙醇消毒液中浸泡3～5min，3%次氯酸鈉浸泡5min，75%乙醇浸泡5min。最后用無(wú)菌水沖洗3～4次，最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布平板做空白對(duì)照。將樣品在滅菌的研缽中研磨，加適量無(wú)菌生理鹽水研磨至勻漿狀。取1mL液體分別按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀釋?zhuān)⒎謩e涂布平板，37℃恒溫培養(yǎng)2d。若對(duì)照處理的分離培養(yǎng)基平板上無(wú)菌落出現(xiàn)，表明植物材料表面消毒徹底，分離到的是內(nèi)生細(xì)菌。挑取單菌落轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基平板上，劃線法純化，純化好的菌株于－80℃冰箱保藏。

1.3.2 耐旱內(nèi)生菌株的篩選

利用PEG6000人工模擬干旱條件[10]，將初篩得到的菌株接種于含有不同質(zhì)量濃度PEG6000的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、170r/min搖床培養(yǎng)1～4d，檢測(cè)培養(yǎng)液的光密度值(OD600nm)。分析菌株在不同質(zhì)量濃度PEG6000中的生長(zhǎng)情況。

1.3.3 菌株生理生化特性

1.3.3.1 菌株形態(tài)

將實(shí)驗(yàn)菌株在NA培養(yǎng)基平板上劃線分離，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)；用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，用顯微鏡觀察菌體形態(tài)[10]。

1.3.3.2 菌株最適培養(yǎng)條件

將篩選所得菌株以2%的接種量接種于NB培養(yǎng)基中，分別置于25、28、32、35、37、40℃條件下，170r/min搖床培養(yǎng)2d。定期測(cè)定培養(yǎng)液的 OD600nm，確定最適培養(yǎng)溫度。

配制一系列pH3、4、5、6、7、8、9的NB培養(yǎng)基，按2%的接種量于最適溫度條件下，170r/min搖床培養(yǎng)2d。定期測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm確定最適pH值。

1.3.3.3 菌株生理生化特性鑒定

采用API50CH試劑條和API50CHB培養(yǎng)基進(jìn)行49種碳水化合物的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。純化的菌株按要求配成一定濁度的懸浮液，按試劑盒說(shuō)明加入到API50CHB培養(yǎng)液中，混勻后加入到0～49號(hào)反應(yīng)凹槽內(nèi)，35℃培養(yǎng)。0號(hào)為陰性對(duì)照。

1.3.4 菌株的16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組，采用16S rDNA通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3＇)和1492R(5＇-GGCTACCTTGTTACGACTT-3＇)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μL，dNTP Mixture 25μL，引物27F與引物1492R各1μL，ddH2O 21μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，33個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物5μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司完成測(cè)序。

登陸GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，將同源性相近的序列通過(guò)ClustalW軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，使用MEGA 4.0軟件以Neighbor-Joining計(jì)算方式生成系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

為了研究植物體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌的耐旱情況，對(duì)13種植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離和純化，根據(jù)NA培養(yǎng)基上的菌落顏色和形態(tài)差異，得到142株內(nèi)生細(xì)菌(表1)。結(jié)果表明，在干旱環(huán)境下的植物體內(nèi)共存著不同種類(lèi)的內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌耐旱情況分析

圖1 內(nèi)生細(xì)菌耐旱性分析Fig.1 Drought-tolerant analysis of endophytic bacteria

根據(jù)菌株在不同質(zhì)量濃度PEG6000的NB培養(yǎng)基中OD600nm的大小進(jìn)行耐旱性分析，結(jié)果如圖1所示，篩選得到的142株內(nèi)生細(xì)菌均有一定的耐旱性。所有菌株均能夠耐受20g/100mL的PEG6000；其中，136株能夠耐受30g/100mL的PEG6000，占所有菌數(shù)的95.8%；67株能夠耐受40g/100mL的PEG6000，占所有菌數(shù)的47.2%；7株能夠耐受50g/100mL的PEG6000，占所有菌數(shù)的4.9%；2株能夠耐受60g/100mL的PEG6000，占所有菌數(shù)的1.4%，選擇其中一株P(guān)B14菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 不同質(zhì)量濃度的PEG6000對(duì)菌株P(guān)B14生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of PEG6000 on the growth of PB14

菌株P(guān)B14分離于白蠟葉片，其在含有不同質(zhì)量濃度PEG6000的NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖2所示。菌株在質(zhì)量濃度為10～30g/100mL的PEG6000培養(yǎng)基中都能很好地生長(zhǎng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為40g/100mL時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到一定的影響，當(dāng)質(zhì)量濃度在50～60g/100mL范圍內(nèi)時(shí)菌株生長(zhǎng)受到較大抑制。

2.3 菌株生理生化特性

2.3.1 菌株形態(tài)

菌株P(guān)B14在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，37℃培養(yǎng)20h后，即可以形成明顯的菌落，菌落直徑約為2mm。菌落呈圓形，不透明，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)可以產(chǎn)生黃褐色色素。革蘭氏染色后在10×100顯微鏡下觀察細(xì)胞呈短直桿狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢染色后呈橢圓形，見(jiàn)圖3。

圖3 菌株P(guān)B14菌落形態(tài)、革蘭氏染色及芽孢染色結(jié)果Fig.3 Morphological characteristics of strain PB14

2.3.2 菌株最適培養(yǎng)條件

圖4 菌株P(guān)B14在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of PB14 strain at different temperatures

如圖4所示，菌株P(guān)B14在25～40℃均能良好生長(zhǎng)，最適溫度為35℃；如圖5所示，菌株P(guān)B14在pH5～8范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，最適pH值為6。

圖5 菌株P(guān)B14在不同pH值培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of PB14 strain at different pH

2.3.3 菌株生理生化特性鑒定結(jié)果

表2 菌株P(guān)B14部分生理生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification of strain PB14

菌株P(guān)B14生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)合API50CHB試劑條結(jié)果(表3)與《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]初步確定該菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

表 3 菌株P(guān)B14的API50CHB試劑條結(jié)果Table 3 API50CHB fermentation results of strain PB14

2.3.4 基于16S rDNA的分子生物學(xué)鑒定

將菌株P(guān)B14的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序后，得到其序列長(zhǎng)度14472bp。使用Blastn在GeneBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，并通過(guò)相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)B14與蠟樣芽孢桿菌的相似度達(dá)到99% 以上，進(jìn)一步確定該菌為蠟樣芽孢桿菌。從GeneBank中選擇11株菌的16S rDNA 基因序列，使用MEGA 4.0軟件進(jìn)行多重比較，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。

圖6 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of the isolate and sequences of relating species

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從典型耐旱植物各器官中分離純化出內(nèi)生細(xì)菌142株，利用NA液體培養(yǎng)基中添加PEG6000來(lái)降低滲透勢(shì)的方法對(duì)其耐旱性進(jìn)行分析，最終篩選得到兩株能夠耐受60g/100mL PEG6000的內(nèi)生細(xì)菌。對(duì)其中一株P(guān)B14進(jìn)行分子生物學(xué)16S rDNA鑒定，并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒定該菌株是一株蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

本結(jié)果表明，典型耐旱植物宿主中分離出的內(nèi)生細(xì)菌都具有一定的耐旱能力。黃明勇等[12]在摸擬干旱條件下，對(duì)分離自金沙江干熱河谷區(qū)45株土著花生根瘤菌進(jìn)行耐旱性鑒定分析，結(jié)果顯示供試菌株耐旱能力呈現(xiàn)多樣性特征。根瘤菌的這種對(duì)干旱環(huán)境表現(xiàn)出的不同反應(yīng)，不僅與其本身對(duì)干旱條件的耐受力有關(guān)，與生長(zhǎng)的環(huán)境也有很大的相關(guān)性，同內(nèi)生菌一樣也是一種協(xié)同進(jìn)化的反應(yīng)[13]。Forchetti等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)利用從干旱土壤的向日葵根際分離出的細(xì)菌處理向日葵種子能夠增加向日葵幼苗的耐旱性。在我國(guó)用叢枝菌根真菌提高柑橘的耐旱性已有報(bào)道[16]，然而對(duì)于利用內(nèi)生細(xì)菌提高植物耐旱性的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)從典型干旱植物體內(nèi)分離篩選出耐旱內(nèi)生細(xì)菌，拓寬了內(nèi)生細(xì)菌資源的應(yīng)用范圍和利用價(jià)值，可為增強(qiáng)植物耐旱性、擴(kuò)大植物應(yīng)用范圍、豐富食品資源及改善其品質(zhì)特性等提供新的思路。

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Isolation and Identification of Drought-tolerant Bacteria from Xerophtes

ZHANG Yan-tao1，SHENG Ji-ping1,2，GE Jia1，JIAO Yu-cui1，WANG Zheng-rong1，CHENG Fan-sheng1，SHEN Lin1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. School of Agricultural Economics and Rural Development, Renmin University of China, Beijing 100872, China)

Drought-tolerant bacteria were isolated and identified in this paper. One hundred and forty two bacterial strains were isolated from the typical drought-tolerant plants. Through adding polyglycol 6000 (PEG6000) to the fluid nutrient medium for decreasing osmotic potential, the drought tolerance of endophytic bacteria were analyzed. One of these strains, PB14, has the capability of drought resistance up to 60 g/100 mL PEG6000. This strain was identified asBacillus cereusbased on morphological and biochemical experiments as well as 16S rDNA sequence analysis.

drought tolerance；endophytic bacteria；identification；Bacillus cereus

TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0124-05

2011-03-30

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(200803033)

張彥濤(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zyt_ly008@126.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)副產(chǎn)品綜合利用。E-mail：shen5000@gmail.com