李星鑫，付一帆，周 宇，李 驥，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

不同熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁品質(zhì)的影響及其DNA穩(wěn)定性分析

李星鑫，付一帆，周 宇，李 驥，潘思軼*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

為探討不同的熱力殺菌條件對(duì)錦橙汁品質(zhì)的影響，采用高溫瞬時(shí)(93℃、30s)，低溫長(zhǎng)時(shí)(70℃、15min)以及目前國(guó)內(nèi)工廠常用的殺菌條件(80℃、10min)對(duì)鮮榨錦橙汁進(jìn)行處理，測(cè)定錦橙汁理化性質(zhì)(色度、pH值、可溶性固形物含量、總酸含量、VC含量、有機(jī)酸含量和還原糖含量)的變化及其殺菌效果，并對(duì)其DNA的穩(wěn)定性進(jìn)行探究。結(jié)果表明，溫度過高或加熱時(shí)間過長(zhǎng)均對(duì)橙汁品質(zhì)產(chǎn)生不好的影響，VC和有機(jī)酸含量大量降解，DNA完整性被破壞。最后得出80℃、10min滅菌的橙汁在品質(zhì)上表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

滅菌條件；橙汁；品質(zhì)；理化性質(zhì)；DNA降解

柑橘類水果是世界最重要的果蔬之一，在食品工業(yè)中有很高的價(jià)值[1]。橙汁是用于果汁加工工業(yè)的主要柑橘類水果[2-3]。鮮榨橙汁的貨架期相對(duì)較短(＜20d，1℃)，并且由于生產(chǎn)過程中對(duì)衛(wèi)生要求嚴(yán)格因此生產(chǎn)成本相對(duì)較高[4]。

為了延長(zhǎng)市售橙汁的貨架期，滅菌成為橙汁加工過程中不可缺少的關(guān)鍵工藝操作。而滅菌過程總是會(huì)或多或少的改變鮮榨橙汁原有的性質(zhì)。為了最大限度地保持產(chǎn)品的特征，近幾年開始運(yùn)用一些冷殺菌技術(shù)[5]，如超高壓[6-7]、高壓脈沖電場(chǎng)[8-9]、輻照滅菌等。但果汁殺菌技術(shù)仍以熱力殺菌為主[10]。

現(xiàn)在大多數(shù)的研究都是針對(duì)不同滅菌方式之間的比較[11]，而對(duì)于同種滅菌方式的滅菌條件研究相對(duì)較少，作為生產(chǎn)中主要滅菌方式之一的熱力滅菌，對(duì)其滅菌條件的評(píng)價(jià)則更值得去探究。關(guān)于果汁品質(zhì)的研究基本上都建立在感官評(píng)定和理化特征的基礎(chǔ)上[12-15]，幾乎沒有將其與分子水平聯(lián)系起來。但是果肉DNA的損害同樣反映了外在條件對(duì)果汁的作用程度，特別是對(duì)于熱力滅菌處理來說，由于DNA具有熱不穩(wěn)定性，因此在加熱條件下造成了果肉DNA的大量降解，這也可以反映熱力滅菌對(duì)于橙汁的影響。同時(shí)較之理化特性相比，從分子水平研究更少受到季節(jié)、地理環(huán)境以及氣候等外界條件的影響，因此提供的信息更為穩(wěn)定。

錦橙作為我國(guó)橙汁加工工業(yè)的常用品種之一，由于果形大，出汁率高，錦橙汁色澤明亮，酸甜適中，微具香氣，受到了廣大商家和消費(fèi)者的喜愛。本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)的錦橙為材料，比較3種不同熱力殺菌條件下錦橙汁理化指標(biāo)的變化及其DNA完整性，更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁品質(zhì)的影響。為錦橙汁加工的熱力加工條件提供理論依據(jù)，同時(shí)根據(jù)各種組成成分的變化為錦橙汁鑒偽領(lǐng)域中快速鑒別加工與鮮榨橙汁提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

錦橙(Citrus sinensisOsbeck.cv.Jincheng)采收自湖北松滋，采收時(shí)間為2010年12月11日。

2000 JP離心式榨汁機(jī) 南通金承機(jī)械有限公司；Orion 410A型酸度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；Hunterlab Ultrascan XE型色度測(cè)定儀 美國(guó)Hunterlab公司；手持糖度儀 成都光學(xué)廠；Waters e2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 樣品制備及處理

錦橙果實(shí)采收后清水洗去表面灰塵，將橙子切成4瓣，置于離心式榨汁機(jī)榨汁，用濾布過濾后將果汁分裝于玻璃瓶中，每瓶裝200mL。取3瓶樣品不作任何處理，作為鮮榨錦橙汁樣品；另取9瓶樣品分為3組，每組3瓶，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室熱力滅菌處理，即將果汁樣品分別置于70℃水浴加熱15min，80℃水浴加熱10min，93℃水浴加熱30s，取出后迅速冷卻至30～40℃。

1.3 理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 pH值

采用酸度計(jì)對(duì)鮮橙汁、3種熱力滅菌條件的果汁進(jìn)行pH值測(cè)定。

1.3.2 可溶性固形物含量

采用手持糖度儀直接進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 總酸含量

采用0.1mol/L NaOH滴定，酚酞作為指示劑。

1.3.4 色度

采用色度測(cè)定儀的透射光模式進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果用L*、a*、b*色彩系統(tǒng)表示。L*為亮度變量，測(cè)量范圍0～100，表示由暗到亮的程度a*和b*是色度坐標(biāo)，a*呈正值時(shí)偏紅色，負(fù)值時(shí)偏綠色；b*呈正值時(shí)偏黃色，負(fù)值時(shí)偏藍(lán)色。

1.3.5 VC含量

采用高效液相色譜法測(cè)定，準(zhǔn)確量取5mL果汁，流動(dòng)相定容至50mL，過濾，濾液用0.45μm濾膜過濾，取10μL濾液進(jìn)樣分析。

色譜條件：色譜柱為Global Chromatographg柱(4.6mm×250mm，5μm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，柱溫：(26±2)℃，流動(dòng)相：0.1g/100mL草酸溶液，流速：0.8mL/min，進(jìn)樣體積：10μL。

1.3.6 有機(jī)酸含量

采用高效液相色譜法，準(zhǔn)確量取10mL果汁，加入30mL流動(dòng)相，水浴超聲波提取20min后，定容至50mL，過濾，用0.45μm濾膜過濾，取10μL濾液進(jìn)樣分析。

色譜條件：流動(dòng)相為水-甲醇(體積比為97:3)，超純水用磷酸調(diào)pH2.6。流速0.5mL/min，Global Chromatographg柱(4.6mm×250mm，5μm)，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。以保留時(shí)間和峰面積測(cè)定錦橙汁中富馬酸、蘋果酸和檸檬酸的含量。

1.3.7 還原糖含量

采用高效液相色譜法，準(zhǔn)確量取10mL果汁，加入30mL蒸餾水，水浴超聲波提取20min后，定容至50mL，過濾，取5mL濾液，用0.45μm濾膜過濾，取10μL濾液進(jìn)樣分析。

色譜條件：Agilent Zorbax Carbohydrate柱(4.6mm× 250mm，5μm)；柱溫：(25±2)℃，檢測(cè)池溫度：35℃，流動(dòng)相：乙腈-水(體積比80:20)；流速：1mL/min；用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。

1.4 細(xì)菌菌落總數(shù)和酵母、霉菌菌落總數(shù)

采用平板計(jì)數(shù)法，取10mL錦橙汁樣品放入含有90mL 0.85g/100mL生理鹽水的玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖制成10倍的稀釋液。將上述樣品稀釋液以10倍梯度稀釋到合適的稀釋度，每個(gè)做2個(gè)平行。細(xì)菌培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于37℃條件下培養(yǎng)24h，霉菌和酵母培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基，酵母菌在28℃條件下培養(yǎng)72h，霉菌在28℃條件下培養(yǎng)72h后開始觀察，并持續(xù)1周。

1.5 DNA的提取及擴(kuò)增

1.5.1 錦橙汁DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB法，量取3mL果汁14000×g離心1min棄上清液，量取1mL CTAB緩沖液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl， 0.1mol/L Tris和20mmol/L EDTA)加入沉淀65℃水浴1h后加氯仿-異戊醇(體積比24:1)混勻，14000×g離心10min，取800μL上清液于新的離心管中，加1.6mL CTAB沉淀緩沖液(5g/L CTAB，0.04mol/L NaCl)，反應(yīng)40min后14000×g離心10min，取沉淀加入500μL 1.2mol/L NaCl，溶解后再加入500μL PCI (苯酚、氯仿、異戊醇體積比為25:24:1)混勻，14000×g離心10min，取300μL上清液加入80μL異丙醇于－80℃靜置30min后14000×g離心10min，用75%乙醇清洗沉淀，自然晾干，加40μL蒸餾水溶解[16]。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

高等植物中高度保守的葉綠體基因rbcL(約1300bp)用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系共50μL，40μL滅菌雙蒸水，5μL 10×Buffer，1μL 2.5mmol/L dNTP，1μL 20μmol/L引物，1.5μL DNA模板，0.5μLTaq酶。引物rbc104和rbcL用于PCR反應(yīng)(表1)。104bprbcL片段的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，50℃復(fù)性45s，72℃延長(zhǎng)30s，循環(huán)40次；72℃延長(zhǎng)10min。1300bprbcL擴(kuò)增片段在53℃條件下復(fù)性，72℃延長(zhǎng)100s，其余條件與104bprbcL片段相同。

表1 實(shí)驗(yàn)所用PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱力滅菌條件下錦橙汁的pH值、可溶性固形物、總酸含量和固/酸比

果汁的可溶性固形物含量和固/酸比已經(jīng)與商業(yè)果汁的該指標(biāo)的可容許范圍之間建立了良好的相關(guān)性[17]。因此，果汁的可溶性固形物含量與固/酸比值一直是評(píng)價(jià)果汁品質(zhì)的重要指標(biāo)。

表2 不同熱力滅菌樣品的pH值、可溶性固形物含量、總酸含量和固/酸比結(jié)果Table 2 pH values, TSS and TA content, and TSS/TA ratio of different heat sterilized samples

從表2可以看出，經(jīng)過不同熱力滅菌條件處理后的錦橙汁pH值變化差異不大，均在3.90～3.95之間，這可能與錦橙汁本身的緩沖體系有關(guān)。然而可溶性固形物含量和固/酸比從低溫長(zhǎng)時(shí)(70℃、15min)到高溫瞬時(shí)(93℃、30s)呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)，且在各滅菌條件下變化趨勢(shì)明顯(P＜0.05)，因此最后得出經(jīng)93℃、30s處理后的錦橙汁的固/酸比值最接近于鮮榨的橙汁。

2.2 不同熱力滅菌條件下錦橙汁色度比較

表3顯示出，經(jīng)過不同條件的熱力滅菌以后，L*和b*值均大于鮮汁，但是a*值卻明顯小于鮮汁，其中，a*和b*值變化差異顯著(P＜0.05)。因此得出，93℃、30s處理后的橙汁a*、b*值較接近于鮮汁，而70℃、15min處理的橙汁L*值與鮮汁接近。從色差值(ΔE)可以看出，70℃、15min處理后與鮮汁的色差值相差最大，其余兩種處理?xiàng)l件的錦橙汁與鮮汁相差較小，且80℃、10min與93℃、30s處理的錦橙汁其色差值相差也并不大。

表3 不同熱力滅菌錦橙汁色度及色差值比較Table 3 Color parameter values of different heat sterilized samples

2.3 不同熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁VC含量的影響

圖1 不同熱力滅菌條件下錦橙汁的VC含量Fig.1 VC content in different heat sterilized Jincheng orange juice

由圖1可知，經(jīng)過不同熱力條件滅菌后，錦橙汁的VC含量均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。其中93℃、30s處理時(shí)，VC含量損失最多，與鮮汁比較，損失率達(dá)到了58.28%。然而70℃、15min處理的錦橙汁VC含量也僅有38.9mg/100mL，損失率最小的為80℃、10min的熱力滅菌條件，VC損失率僅有23.9%。因此可以看出處理溫度過高以及處理時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)使果汁中的VC造成大量損失。

2.4 不同熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁有機(jī)酸含量的影響

橙汁中的蘋果酸、檸檬酸、富馬酸等有機(jī)酸對(duì)于評(píng)價(jià)果汁的質(zhì)量非常重要。蘋果酸在加熱條件下會(huì)形成富馬酸[18]，霉菌利用果實(shí)中的葡萄糖會(huì)產(chǎn)生富馬酸，微生物自身代謝也會(huì)產(chǎn)生富馬酸。若在果汁中檢測(cè)出大量的富馬酸，則表明是摻假或加工過度。

由圖2可知，有機(jī)酸的測(cè)定結(jié)果與VC含量相似。熱滅菌處理以后的錦橙汁檸檬酸和蘋果酸含量均有所下降，其中93℃、30s處理時(shí)變化最為明顯，檸檬酸損失率達(dá)到了19.9%，蘋果酸損失率為31.7%。而80℃、10min處理的橙汁有機(jī)酸的含量均與鮮汁相當(dāng)。在鮮汁及3個(gè)不同熱處理的錦橙汁中，測(cè)得的富馬酸含量極少(＜0.01mg/mL)，因此認(rèn)為這3種不同的熱力滅菌條件均沒有引起過度加工。

圖2 不同熱力滅菌條件下錦橙汁的有機(jī)酸含量Fig.2 Organic acid concentration in different heat sterilized Jincheng orange juice

2.5 不同熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁還原糖含量的影響

表4 3種熱力滅菌條件錦橙汁與鮮汁還原糖含量的比較Table 4 Reducing sugars in Jincheng orange juice prepared by 3 different heat sterilization methods

糖類是影響果汁風(fēng)味和質(zhì)量的重要物質(zhì)，由表4可知，除80℃、10min處理錦橙汁的果糖含量外，經(jīng)過熱力滅菌以后的錦橙汁其蔗糖和果糖的含量均有所下降。經(jīng)過93℃、30s處理的錦橙汁3種還原糖含量均明顯低于鮮汁水平，可能是由于溫度過高造成了糖類物質(zhì)的降解。80℃、10min處理的錦橙汁其果糖和葡糖糖的含量都有明顯的增加，蔗糖的含量相對(duì)減少。針對(duì)這一結(jié)果推測(cè)，可能是加熱條件下致使大分子的糖類物質(zhì)水解為葡萄糖，同時(shí)蔗糖與果糖之間的轉(zhuǎn)化也可能發(fā)生，從而使得果糖的含量相對(duì)增高。

2.6 不同熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁中微生物的影響

通過對(duì)微生物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鮮汁中的細(xì)菌總數(shù)為1900CFU/mL，酵母及霉菌總數(shù)為780CFU/mL，而3種熱處理后的錦橙汁均沒有檢測(cè)出細(xì)菌、酵母和霉菌。結(jié)果表明，這3種熱力滅菌條件已經(jīng)符合商業(yè)要求水平。對(duì)于這一結(jié)果除熱力殺菌的原因外，錦橙汁本身的酸性條件也不適合大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)。但從鮮汁的檢測(cè)結(jié)果可以看出在未經(jīng)滅菌的錦橙汁里仍然有大量細(xì)菌存在，初步預(yù)計(jì)為一些嗜酸性的微生物，因?yàn)橐延邢嚓P(guān)的報(bào)道稱這些嗜酸性的微生物為橙汁的主要污染物[19]。

2.7 不同熱力滅菌條件下錦橙汁的DNA穩(wěn)定性分析

分子水平能夠更為直觀的表現(xiàn)出不同熱力滅菌條件對(duì)果汁的影響，并且不受地理和果汁本身原料的影響，大大降低了評(píng)價(jià)的誤差。同時(shí)通過對(duì)熱力滅菌條件下果汁穩(wěn)定性的分析，可以更為快速地鑒別加工與鮮榨果汁。

圖3 不同熱力滅菌條件下錦橙汁rbcL基因擴(kuò)增條帶Fig.3 Amplification of rbcL gene from Jincheng orange juice prepared by 3 different heat sterilization methods

由圖3可知，鮮汁和經(jīng)不同的熱力滅菌后的錦橙汁均能夠檢測(cè)出PCR反應(yīng)條帶。4種錦橙汁的100bp擴(kuò)增片段無明顯的差別(圖3a)，均有明顯的亮帶。而3種熱力滅菌條件下錦橙汁的1300bp擴(kuò)增片段瓊脂糖檢測(cè)的條帶逐漸減弱(圖3b)，其中93℃、30s處理的錦橙汁條帶最暗。結(jié)果表明熱力滅菌對(duì)橙汁的DNA造成了破壞，當(dāng)擴(kuò)增的片段越長(zhǎng)時(shí)其DNA的完整性越低，而擴(kuò)增長(zhǎng)度較短時(shí)各個(gè)樣品間的差異并不明顯。其中高溫條件下DNA的穩(wěn)定性最差，發(fā)生了大量的降解(表5)。

表5 不同熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁基因組DNA完整性的影響Table 5 Effect of sterilization methods on genomic DNA integrity of Jincheng orange juice

3 結(jié) 論

經(jīng)過熱力滅菌以后，錦橙汁的各項(xiàng)理化指標(biāo)均發(fā)生了變化，其中以VC含量的變化最為顯著。而pH值和可溶性固形物的變化卻不明顯，這可能與錦橙汁本身的緩沖體系有關(guān)?？偹岬暮枯^鮮汁中均有下降，估計(jì)這與加熱過程致使VC降解有一定的聯(lián)系。在還原糖測(cè)定中，蔗糖及果糖含量均有降低，加熱水解以及蔗糖與果糖的相互轉(zhuǎn)化在這一過程中均有可能發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)最后對(duì)3種熱力滅菌條件對(duì)錦橙汁DNA的穩(wěn)定性做了研究，得出熱力滅菌極大程度地造成了基因組DNA的損害。有研究表明加熱溫度越高對(duì)DNA的損害程度越大[14]。目前在加工中關(guān)于DNA方面的研究還較少，而本實(shí)驗(yàn)只是初步探究，還需要對(duì)其做進(jìn)一步的深入研究，為錦橙汁加工及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論支持。

從3個(gè)熱力滅菌的條件對(duì)錦橙汁的影響可以看出，高溫短時(shí)(93℃、30s)處理后VC含量和還原糖含量，還有基因組DNA均受到了很大程度的損害，雖然低溫長(zhǎng)時(shí)(70℃、15min)的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于93℃、30s處理的錦橙汁，但較80℃、10min處理的錦橙汁來說，在VC含量和還原糖含量上還是有所欠缺，因此綜合各個(gè)方面的因素考慮，時(shí)間太長(zhǎng)或是溫度過高都對(duì)錦橙汁的品質(zhì)不利，目前國(guó)內(nèi)通用的80℃、10min的滅菌方式對(duì)錦橙汁損害較小，在各項(xiàng)理化指標(biāo)以及DNA完整性上都表現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)。

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Effects of Different Heat Sterilization Treatments on Jincheng Orange Juice Quality and Its DNA Stability

LI Xing-xin，F(xiàn)U Yi-fan，ZHOU Yu，LI Ji，PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Fresh Jincheng orange juice was treated by high-temperature instantaneous method (93 ℃, 30 s), low-temperature and long-time method (70 ℃, 15 min) and the method (80 ℃, 10 min) commonly used by domestic enterprises in order to study the effects of different heat sterilization methods on the quality of orange juice. Physio-chemical characteristics including juice color, pH, total soluble solids (TSS), titratable acidity (TA), VC, organic acids, reducing sugars and microbiological indexes of Jincheng orange juice were determined. At the same time DNA integrity was preliminarily studied. The results showed that both high temperature and long heating time had an unfavorable effect on orange juice, the contents of VC and organic acids decreased and genomic DNA integrity was significantly impaired. Based on the data obtained, it can be concluded that treatment at 80 ℃for 10 min is better than the other two in maintaining the quality of orange juice.

sterilization method；orange juice；quality；physio-chemical characteristics；DNA degradation

TS255.44

A

1002-6630(2012)05-0109-05

2011-05-21

李星鑫(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：starlxx520@yahoo.com.cn

*通信作者：潘思軼(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：pansiyi@mail.hzau.edu.cn