胡喜蘭，姜 琴，尹福軍，劉 濤

(淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

花果山“糯米茶”中黃酮化合物的分離純化及活性研究

胡喜蘭，姜 琴，尹福軍，劉 濤

(淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

利用溶劑提取法對(duì)花果山“糯米茶”中的黃酮化合物進(jìn)行提取，并利用硅膠柱色譜分離法對(duì)其進(jìn)行分離純化，同時(shí)通過(guò)DPPH抗氧化活性體外評(píng)價(jià)體系測(cè)定其清除自由基的能力。結(jié)果顯示，“糯米茶”中的黃酮化合物具有一定的的清除DPPH自由基的能力，“糯米茶”是可開發(fā)的抗衰老、抗氧化的保健茶。

糯米茶；黃酮化合物；提?。换钚?/p>

流蘇，是連云港市云臺(tái)山脈的特有樹種，是珍貴的綠化樹種，又是制作盆景的好材料。春天采其嫩葉，陰干，制成茶稱為“糯米茶”。用其花制茶稱為“糯米花茶”，清香爽口，別具一番風(fēng)味，它們的藥理作用多樣，化學(xué)成分復(fù)雜，民間還常用糯米茶消積食，清內(nèi)火，有明目之功能，茶渣可治胃病和小兒腹瀉，具有藥用價(jià)值[1]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)其有效成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，所以研究和開發(fā)“糯米茶”的有效成分是很有必要的。本課題組選擇連云港特有的“糯米茶”進(jìn)行研究，測(cè)定了礦物元素、茶多酚、黃酮化合物和多糖的含量[2]，利用溶劑提取法對(duì)糯米茶中的黃酮化合物進(jìn)行提取，并利用層析法對(duì)其進(jìn)行分離純化，同時(shí)通過(guò)DPPH自由基抗氧化活性體外評(píng)價(jià)體系測(cè)定其清除自由基的能力，為其綜合應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花果山“糯米茶”由江蘇連云港康緣大藥房吳舟中藥師提供。用前將其置于烘箱中，55℃條件下干燥恒質(zhì)量后粉碎，過(guò)40目篩，保存于磨口瓶中并置于干燥避光處，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 南京替斯艾么中藥研究所；槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品鑒定所；異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó) BioChemika公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma Aldrich公司；VC、合成抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、無(wú)水甲醇(色譜純)、無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水甲醇、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱 鄄城華魯儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠；B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；ZFI型四用紫外分析儀 上海顧村電光儀器廠；UV-2550紫外分光光度計(jì)、LC-10ADVP型高壓液相色譜儀、CLASS-VP工作站、SPD-M10AVP二極陣列檢測(cè)器 日本島津公司；X-4顯微熔點(diǎn)儀 上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮化合物的提取

將“糯米茶”研磨、過(guò)40目篩，各取20g于20mL燒瓶中，加入約10倍的80%乙醇溶液于80℃水浴鍋中進(jìn)行溶劑提取1.5h，重復(fù)3次，將濾液進(jìn)行減壓抽濾，合并濾液。將所獲得的濾液移入梨形瓶，進(jìn)行濃縮。濃縮后的物質(zhì)因黏于梨形瓶壁，所以使用餾分將其全部溶解轉(zhuǎn)移入50mL燒杯，并將燒杯用保鮮膜封口，并戳幾個(gè)小洞，使小瓶中的溶液揮干，而又不被污染，得粗提物，備用[3-4]。

1.3.2 黃酮化合物的分離、純化

利用硅膠柱色譜分離[5-8]，采取濕法裝柱，干法上樣，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、50%的乙醇溶液對(duì)粗提物進(jìn)行洗脫，至溶液基本無(wú)色，將所獲得的洗脫液進(jìn)行濃縮，濃縮后的物質(zhì)因黏于瓶壁，所以使用餾分將其全部溶解轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中，用保鮮膜封口，并戳幾個(gè)小洞眼，使瓶中的溶劑揮干，共收集得到A、B、C、D、E、F、G7個(gè)樣品。

1.3.3 薄層色譜(TCL)檢測(cè)

首先進(jìn)行展開劑條件摸索，把上述樣品用毛細(xì)管蘸取液體按一定順序點(diǎn)在硅膠板上，放置層析缸跑板。而層析缸中依次為乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(體積比8:2)、乙酸乙酯-甲醇(體積比6:4)、乙酸乙酯-甲醇(體積比2:8)、甲醇、甲醇-水(體積比8:2)、甲醇-水(體積比6:4)溶液量為10mL。一般約經(jīng)30～40min，跑板結(jié)束，在紫外燈下清楚可見(jiàn)跑板情況，觀察其是否有拖尾或含其他雜質(zhì)等現(xiàn)象。

1.3.4 熔點(diǎn)測(cè)定

將樣品進(jìn)行重結(jié)晶，對(duì)析出的產(chǎn)品進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，并與常見(jiàn)的黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品，如蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetrin)、山奈酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)對(duì)比。

1.3.5 高效液相色譜檢測(cè)

設(shè)置條件為：壓力：0～40MPa；顯示精度：±2%；流速：1mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；操作溫度：4～35℃；流動(dòng)相：甲醇(色譜純)；波長(zhǎng)：360nm；取少量樣品于小瓶?jī)?nèi)，將其溶劑揮干后，用適量甲醇溶解，待用[9]。

1.3.6 樣品的抗氧化活性測(cè)定

采用DPPH自由基法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取DPPH自由基，配制質(zhì)量濃度為0.049mg/mL的DPPH自由基-乙醇溶液。以乙醇為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別取0.1mL樣品溶液，加入3.9mL質(zhì)量濃度為2.5mg/100mL DPPH自由基-乙醇溶液，以乙醇替代樣液為空白掃基線。將混合溶液搖勻，用比色皿，在515nm波長(zhǎng)處測(cè)定其在不同時(shí)間的吸光度，根據(jù)下式計(jì)算DPPH自由基清除率[10-15]。

式中：AT為自由基清除過(guò)程中某一時(shí)刻DPPH自由基的吸光度；A0為以乙醇替代樣品溶液的DPPH自由基的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮化合物的分離、純化

石油醚洗脫過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)洗脫液有顏色變化，僅在柱上端有黃色柱段出現(xiàn)，但一段時(shí)間沒(méi)有位移，改換乙酸乙酯，有灰綠色物質(zhì)洗出，用接收瓶A收集；洗脫液變淺發(fā)黃時(shí)，用接收瓶B收集；當(dāng)柱內(nèi)的有顏色部位基本沒(méi)有位移時(shí)，換乙醇進(jìn)行洗脫，用吸收瓶C收集；當(dāng)有深綠色物質(zhì)洗出時(shí)，用吸收瓶D收集；當(dāng)洗脫液變淺時(shí)，用吸收瓶E收集；當(dāng)有黃色物質(zhì)洗出時(shí)，用吸收瓶F吸收；在柱內(nèi)的有顏色部位基本沒(méi)有位移時(shí)，用50%的乙醇溶液洗脫，由收集瓶G收集。A、C、D中溶劑揮干后基本沒(méi)有產(chǎn)品，故對(duì)樣品B、E、F、G進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)。

2.2 TCL檢測(cè)結(jié)果

圖1 樣品B、E、F、G在不同展開劑中的薄層色譜圖Fig.1 TCL spectra of samples B, E, F and G in different mobile phases

由圖1可知，甲醇的展開效果最好，即適用純甲醇做展開劑最佳，故高效液相色譜選用甲醇作為流動(dòng)相。硅膠柱色譜得到的樣品B、E較多，有一定的研究?jī)r(jià)值，故與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(R)、槲皮素(Q)、山奈酚(K)、異鼠李素(I)進(jìn)行TCL對(duì)比，為防止各樣品發(fā)生拖尾現(xiàn)象，更好地分離區(qū)別開樣品B和E，選用甲醇中加入甲酸作為展開劑，甲醇-甲酸(體積比9:1)10mL做進(jìn)一步展開劑[6]，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 樣品B、E、R、Q、K、I的薄層色譜圖Fig.2 TCL spectra of samples B, E, R, K and I

由圖2可知，樣品E拖尾較長(zhǎng)，可能不是純化合物，還需進(jìn)一步的純化，樣品B可能是蘆丁(R)、槲皮素(Q)、山奈酚(K)、異鼠李素(I)中的一種，故對(duì)其熔點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

樣品B在甲醇中結(jié)晶，析出淺黃色的粉末，其熔點(diǎn)為263～266℃，與幾種標(biāo)準(zhǔn)品的熔點(diǎn)比較，相差較大，說(shuō)明樣品B不是上述幾種標(biāo)準(zhǔn)品之一的產(chǎn)物。通過(guò)紫外譜圖查證，結(jié)合熔點(diǎn)，初步判斷B與7-羥基-4′-甲氧基異黃酮(C16H12O4)，熔點(diǎn)為263～264℃(甲醇中重結(jié)晶)，與芒柄花黃素有相似之處，但確認(rèn)還需要對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化分離，并利用相關(guān)質(zhì)譜、氫譜、碳譜等進(jìn)行表征，進(jìn)一步的研究有待進(jìn)行。

2.4 高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果

圖3 粗提物(a)、樣品B(b)、樣品E(c)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC spectra of crude extracts and samples B and E

由圖3可知，粗提物在6min左右有兩個(gè)明顯的峰，且相互交融，經(jīng)過(guò)柱色譜分離，從粗提物中分離出了兩種黃酮化合物B和E，且通過(guò)峰面積計(jì)算，B的相對(duì)含量為99.72%，E的相對(duì)含量為99.54%。因樣品B含量較樣品E高，故下面選擇樣品B進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

2.5 清除 DPPH 自由基的能力

利用 DPPH的褪色效應(yīng)，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的樣品B在不同時(shí)間的吸光度，同時(shí)與0.56mg/mL VC及合成抗氧化劑TBHQ(0.55mg/mL)比較，計(jì)算不同質(zhì)量濃度樣品B溶液對(duì)DPPH自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度樣品B對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 DPPH radical scavenging ability of VE, TBHQ and flavonoids from glutinous rice tea

由圖4可知，在加入不同質(zhì)量濃度樣品B后，DPPH自由基的清除作用隨著樣品B質(zhì)量濃度的增加而增大，且隨著時(shí)間的推移，DPPH自由基的清除作用也在慢慢增加，其自由基的清除作用雖沒(méi)有VC、TBHQ的強(qiáng)烈，但也具有一定的作用。

3 結(jié) 論

由于黃酮化合物酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化，且對(duì)活性氧等自由基有較強(qiáng)的捕捉能力，使黃酮化合物具有一定的抗氧化性和清除自由基的能力，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，“糯米茶”中含有的一定量的黃酮化合物，并具有一定的的清除 DPPH自由基的能力，說(shuō)明“糯米茶”具有一定的體外抗氧化活性，可開發(fā)為抗衰老、抗氧化的保健茶。

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Extraction and Activity of Flavonoids from Glutinous Rice Tea Grown in Huaguo Mountain

HU Xi-lan，JIANG Qin，YIN Fu-jun，LIU Tao
(College of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Flavonoids were extracted from glutinous rice tea grown in Huaguo Mountain by solvent extraction and isolated by column chromatography on silica gel. The antioxidant activityin vitrowas determined by DPPH free radical scavenging assay. The results indicated that flavonoids from glutinous rice tea had certain free radical scavenging ability. In conclusion, glutinous rice tea has the potential to be developed as an anti-aging and antioxidant health-care tea.

glutinous rice tea；flavonoids；extraction；activity

R284

A

1002-6630(2012)05-0106-03

2011-09-26

連云港市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(CG0806)；淮海工學(xué)院引進(jìn)人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KK01060)

胡喜蘭(1961—)，女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)榕湮换瘜W(xué)和天然藥物化學(xué)的提取及應(yīng)用。E-mail：huxilan@hhit.edu.cn