余沐洋，張 萌，高凌峰，何建波*

(合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

白藜蘆醇與紫檀芪抗氧化活性差異的電化學(xué)研究

余沐洋，張 萌，高凌峰，何建波*

(合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

為揭示白藜蘆醇(反式)與其衍生物紫檀芪的抗氧化活性差異的內(nèi)在原因，對(duì)兩種物質(zhì)的氧化機(jī)理進(jìn)行研究。采用循環(huán)伏安法考察pH值、富集時(shí)間對(duì)氧化過(guò)程的影響，采用薄層長(zhǎng)光程紫外-可見(jiàn)光譜電化學(xué)方法原位監(jiān)測(cè)氧化產(chǎn)物的形成。結(jié)果表明：紫檀芪在油性碳糊電極表面上的吸附富集作用遠(yuǎn)強(qiáng)于白藜蘆醇；兩者的初始氧化都發(fā)生在對(duì)位羥基上，通過(guò)一電子一質(zhì)子傳遞步驟生成苯氧自由基中間體；紫檀芪自由基中間體易于耦合迅速轉(zhuǎn)化為二聚體產(chǎn)物，而白藜蘆醇自由基在堿性介質(zhì)中需經(jīng)歷較難進(jìn)行的中間雙鍵斷裂途徑，轉(zhuǎn)化為可溶性小分子產(chǎn)物。紫檀芪較強(qiáng)的親脂性引起的富集作用以及氧化中間體的快速二聚化，是其具有較強(qiáng)抗氧化活性的重要原因。

抗氧化活性；白藜蘆醇；紫檀芪；循環(huán)伏安法；原位光譜電化學(xué)

白藜蘆醇(3,4′,5-三羥基-1,2二苯乙烯)廣泛存在于葡萄、花生、虎杖、藜蘆、決明等許多植物中，并且在葡萄酒中含量豐富[1]，具有預(yù)防心腦血管疾病、防癌、抗炎、抗氧化、抗病原微生物等多種生理保健作用[1-2]。作為一種天然的非黃酮類(lèi)多酚化合物，白藜蘆醇具有良好的抗氧化和自由基清除作用，可用于醫(yī)藥和食品工業(yè)[3]。紫檀芪是白藜蘆醇的3,5位兩個(gè)酚羥基被甲氧基取代的衍生物，主要存在于葡萄、藍(lán)莓和西紅柿等漿果中，近年來(lái)由于其潛在的抗癌、抗氧化、抗炎、抗糖尿病等功效而備受關(guān)注[4-6]。雖然羥基的數(shù)量及位置通常是決定天然多酚產(chǎn)物生物活性的主要因素，但僅保留有4′位羥基的紫檀芪卻能表現(xiàn)出與白藜蘆醇相當(dāng)甚至更強(qiáng)的抗氧化活性[6-8]。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中紫檀芪具有與白藜蘆醇相似的抗氧化能力[6]。在保護(hù)紅細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化方面，紫檀芪作用顯著(IC50＝(44.5±7.8)μmol/L)，而白藜蘆醇的功效卻明顯較小[7]。據(jù)最近的報(bào)道，在預(yù)防氧化偶氮甲烷誘發(fā)的結(jié)腸癌方面，紫檀芪也比白藜蘆醇更有效，其作用機(jī)制是通過(guò)激活NF-E2相關(guān)因子2調(diào)控的抗氧化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]。

針對(duì)白藜蘆醇和紫檀芪的抗氧化活性與羥基數(shù)目負(fù)相關(guān)的內(nèi)在原因，本實(shí)驗(yàn)試圖從電化學(xué)角度進(jìn)行一些解釋。電化學(xué)伏安法的氧化峰電勢(shì)、氧化峰電流等參數(shù)，已被用于抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-11]。近年來(lái)對(duì)一系列天然黃酮類(lèi)化合物的抗氧化機(jī)制進(jìn)行了電化學(xué)研究[12-14]，從電氧化反應(yīng)機(jī)理探討抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)中選用石墨-固態(tài)石蠟碳糊電極作為工作電極，石蠟使電極表面具有較好的油脂性及生物相容性。迄今對(duì)白藜蘆醇的電化學(xué)研究已有一些報(bào)道，包括白藜蘆醇的伏安行為及電氧化機(jī)理[15]、電化學(xué)分析[16]和與DNA的相互作用[17]等，而對(duì)紫檀芪尚未見(jiàn)電化學(xué)研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法考察pH值、富集時(shí)間等對(duì)紫檀芪氧化過(guò)程的影響，薄層長(zhǎng)光程紫外-可見(jiàn)光譜電化學(xué)監(jiān)測(cè)氧化產(chǎn)物的形成，以深入研究其氧化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇和紫檀芪(純度 99%) 杭州廣林生物醫(yī)藥有限公司。

石墨粉(光譜純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI600B電化學(xué)工作站 上海辰華儀器公司；UVVis-2500型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司。

在自制的直徑3mm石墨-石蠟碳糊電極[18]上進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，在7mm×9mm的方形碳糊電極上進(jìn)行光譜電化學(xué)測(cè)試。輔助電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl/KClsat電極。采用普通的10mm光程的石英光度池自制薄層長(zhǎng)光程光譜電化學(xué)池[18]，薄層腔厚度0.2mm。

1.3 電解液的配制

用乙醇為溶劑分別配制濃度1.0mmol/L白藜蘆醇和紫檀芪的儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存。以體積比20:80的乙醇和水為混合溶劑配制不同pH值的0.2mol/L B-R緩沖液(另含0.5mol/L KCl)，pH值梯度為1.8、2.8、3.8、4.8、6.0、7.4、8.5、9.5和10.5。測(cè)定前取90mL緩沖液稀釋10mL儲(chǔ)備液，得到0.1mmol/L的電解液。除自然氧化實(shí)驗(yàn)外，電解液在使用前通高純氮?dú)?5min除氧。

1.4 測(cè)試方法

在常規(guī)電解池中進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)測(cè)量，分別考察電解液pH值、富集時(shí)間、富集電勢(shì)、掃描速率等對(duì)CV的影響。在薄層電解池中進(jìn)行動(dòng)態(tài)UV-Vis光譜測(cè)試，在恒電勢(shì)氧化過(guò)程中，在500～200nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)反復(fù)快速掃描，采樣間隔1nm，每20s記錄一條譜線(xiàn)，持續(xù)至譜線(xiàn)變化基本穩(wěn)定(電解前亦記錄一條譜線(xiàn))。掃速速率為100mV/s，掃描前在起始電勢(shì)下富集60s。自然氧化在普通石英光度池中進(jìn)行，因反應(yīng)速率慢，每1800s 記錄一條譜線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。使用過(guò)的碳糊電極在0.1mol/L NaHCO3溶液中0～1.6V電勢(shì)范圍內(nèi)清洗掃描30圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)白藜蘆醇和紫檀芪的初始氧化峰的影響

圖1 不同pH值條件下白藜蘆醇(a)和紫檀芪(b)的循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammograms of resveratrol (a) and pterostilbene (b) at different pH values

多酚化合物的抗氧化活性主要取決于分子中最易被氧化的羥基，對(duì)應(yīng)于循環(huán)伏安曲線(xiàn)上的第一個(gè)氧化峰[9]。由圖1可知，隨著pH值由酸性變化到堿性，白藜蘆醇的第一氧化峰峰形變差且峰電流(ip)明顯減小(圖1a)；紫檀芪的氧化峰電流變化不顯著，但可分辨出相距很近的兩個(gè)重疊峰(圖1b)，表明包括兩個(gè)串聯(lián)的失電子步驟。

由圖2可知，白藜蘆醇的峰電勢(shì)(Ep)隨pH值增大而負(fù)移但線(xiàn)性關(guān)系差：Ep/V＝0.812－0.056 pH(r＝ －0.978)，斜率為56mV，表明起始氧化步驟有等數(shù)量的電子和質(zhì)子參與。紫檀芪第一氧化峰的峰電勢(shì)與pH值之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系Ep/V＝0.775－0.054 pH(r＝ －0.995)，斜率為54mV，再考慮到僅在4′位上有一個(gè)羥基，推斷在該位置發(fā)生了一電子一質(zhì)子氧化反應(yīng)，生成了苯氧自由基中間體，反應(yīng)方程如式(1)所示。4′位羥基的電化學(xué)活性受另一苯環(huán)上取代基的影響應(yīng)很小，而實(shí)測(cè)的白藜蘆醇第一氧化峰電勢(shì)與紫檀芪的相差不大，因此也應(yīng)是4′位羥基的氧化。這個(gè)對(duì)位羥基的pKa值(pKa1＝8.8)小于其他兩個(gè)間位羥基(pKa2＝9.8，pKa3＝11.4)，許多研究已發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇4′位羥基對(duì)其在細(xì)胞遺傳學(xué)、清除自由基、抗氧化和抗增殖等方面的活性是十分重要的[19]。峰電流和峰電勢(shì)兩方面數(shù)據(jù)都表明，白藜蘆醇的氧化途徑受pH值影響比紫檀芪復(fù)雜。對(duì)兩種物質(zhì)都沒(méi)有觀察到對(duì)應(yīng)的還原峰，表明電氧化過(guò)程都是不可逆的。

圖2 白藜蘆醇和紫檀芪的第一氧化峰的峰電勢(shì)與pH值的關(guān)系Fig.2 Effects of pH on peak potentials for initial oxidation of resveratrol and pterostilbene

式(1)中的苯氧自由基可發(fā)生異構(gòu)化，與3′位碳自由基和中心雙鍵上的碳自由基共存[20]，并將繼續(xù)轉(zhuǎn)化為沒(méi)有電還原活性的穩(wěn)定產(chǎn)物。后面將結(jié)合原位光譜電化學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步討論。

圖1中的氧化峰電勢(shì)和氧化峰電流可反映抗氧化活性的強(qiáng)弱[9-11]。以生理pH7.4為例，紫檀芪和白藜蘆醇的峰電勢(shì)分別為0.39V和0.44V，峰電流分別為3.57μA和2.64μA，都表明紫檀芪的抗氧化活性強(qiáng)于白藜蘆醇?？梢?jiàn)從電化學(xué)參數(shù)分析兩者抗氧化性的相對(duì)強(qiáng)弱與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[7-8]相符。

2.2 富集時(shí)間對(duì)白藜蘆醇和紫檀芪氧化峰的影響

在不同富集時(shí)間后記錄白藜蘆醇和紫檀芪的CV曲線(xiàn)，分別示于圖3。反應(yīng)物濃度均為0.1mmol/L，支持電解液為0.2mol/L B-R緩沖液(pH7.4) + 0.5mol/L KCl，掃速速率為100mV/s。將第一氧化峰的峰電流對(duì)富集時(shí)間作圖，得到圖4?？梢钥闯?，峰電流隨著富集時(shí)間延長(zhǎng)而增大，其中紫檀芪的峰電流增大幅度顯著大于白藜蘆醇；白藜蘆醇的峰電流在富集300s之前已基本達(dá)到穩(wěn)定，而紫檀芪的峰電流在富集600s之后仍在增大。這表明兩個(gè)間位羥基被甲氧基取代使紫檀芪的親脂性增強(qiáng)，從而在石蠟碳糊電極表面發(fā)生更強(qiáng)的吸附?？梢?jiàn)，紫檀芪較強(qiáng)的親脂性使其具有較高的生物利用度，促進(jìn)了抗氧化活性；而白藜蘆醇的生物利用度較低[1]也可能與其親脂性較弱有關(guān)。已有研究者推測(cè)親脂性較強(qiáng)是紫檀芪具有較高生物活性的可能原因[21]。

另一方面，富集電勢(shì)的正移使兩種反應(yīng)物的氧化峰電流有所增大，但影響較小。此外，在2～800mV/s的掃速范圍內(nèi)獲得了峰電流與掃速一次方的正比關(guān)系，也證明了兩種反應(yīng)物在電極表面的吸附。

圖3 不同富集時(shí)間后白藜蘆醇(a)和紫檀芪(b)的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of resveratrol (a) and pterostilbene (b) after different accumulation time

圖4 白藜蘆醇和紫檀芪的第一氧化峰的峰電流與富集時(shí)間的關(guān)系Fig.4 Effects of accumulation time on peak currents for initial oxidation of resveratrol and pterostilbene

2.3 堿性介質(zhì)中氧化過(guò)程的原位UV-Vis光譜

堿性介質(zhì)中兩種物質(zhì)在空氣中就可自然氧化，便于與電氧化比較；堿液中兩者抗氧化活性差別也更大(圖1峰電流)。圖5分別是1.0mmol/L白藜蘆醇(pH9.5)電氧化和自然氧化的原位薄層UV-Vis光譜變化，其中電氧化在恒電勢(shì)0.35V條件下進(jìn)行。圖5中兩圖呈現(xiàn)出一致的光譜變化趨勢(shì)，可見(jiàn)電氧化和自然氧化生成了相同的氧化產(chǎn)物，主要差異在于電氧化的速率約為自然氧化的100倍。氧化前，白藜蘆醇分別在215nm和312nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)兩個(gè)特征吸收峰Ⅰ和Ⅱ(圖5中第一條譜線(xiàn))，后者對(duì)應(yīng)于由中心雙鍵相連的整個(gè)分子的π-π共軛。當(dāng)施加氧化電勢(shì)后，光譜的變化在238、278nm和365nm波長(zhǎng)處形成3個(gè)等吸點(diǎn)，表明可溶性產(chǎn)物的生成；312nm吸收峰Ⅱ顯著減弱至峰形趨于消失，表明共軛鏈在產(chǎn)物分子中被縮短，中心雙鍵或已斷裂；吸收峰Ⅰ僅有少量減弱，同時(shí)在250nm附近產(chǎn)生一新吸收峰Ⅲ，表明苯環(huán)結(jié)構(gòu)仍然存在。

Pezet等[22]報(bào)道了白藜蘆醇在過(guò)氧化物酶作用下生成兩種氧化二聚體ε-/δ-葡萄素。Camont等[23]近期報(bào)道了白藜蘆醇在水溶液中被·OH氧化的4種產(chǎn)物，為云杉鞣酚(在白藜蘆醇的3′位上增加了一個(gè)羥基)、3,5-二羥基苯甲酸、3,5-二羥基苯甲醛和4-羥基苯甲醛。無(wú)論是葡萄素還是云杉鞣酚，分子中共軛鏈沒(méi)有縮短，與吸收峰Ⅱ的消失不符。后3種苯甲酸(或醛)衍生物是白藜蘆醇中心雙鍵氧化斷裂而生成的，而苯甲酸(或醛)的特征吸收峰與圖5中吸收峰Ⅰ和Ⅲ相近，如3,5-二羥基苯甲酸在水溶液中最大波長(zhǎng)吸收峰在243nm[24]。

圖5 白藜蘆醇電氧化(a)和自然氧化(b)的原位薄層UV-Vis光譜Fig.5 in situ UV-Vis spectra during electro-oxidation (a) and natural oxidation (b) of resveratrol

圖6 紫檀芪電氧化(a)和自然氧化(b)的原位薄層UV-Vis光譜Fig.6 in situ UV-Vis spectra during electro-oxidation (a) and natural oxidation (b) of resveratrol

圖6分別給出了紫檀芪電氧化和自然氧化的光譜變化圖，實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)與上述白藜蘆醇的完全一致。看出紫檀芪的電氧化和自然氧化的光譜變化趨勢(shì)也相同，自然氧化比白藜蘆醇慢得多。氧化前，紫檀芪分別在217nm和312nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)兩個(gè)特征吸收峰Ⅰ和Ⅱ。當(dāng)施加氧化電勢(shì)后，兩個(gè)吸收峰顯示幾乎同步的減弱，未形成等吸收點(diǎn)，表明沒(méi)有可溶性的吸光物質(zhì)生成，而是在電極表面上生成了沉積物，其親脂性比紫檀芪更強(qiáng)。這使得電極表面被鈍化，阻礙了薄層腔中反應(yīng)物的耗竭性電解，兩個(gè)特征吸收峰不能達(dá)至消失。最近Rodríguez-Bonilla等[20]首次報(bào)道了紫檀芪在過(guò)氧化物酶作用下的氧化產(chǎn)物及反應(yīng)機(jī)理，提出式(1)中的苯氧自由基具有3種同分異構(gòu)體，兩兩之間發(fā)生自由基-自由基耦合反應(yīng)，生成脫氫二聚體(順式和反式)和開(kāi)式二聚體，它們都具有顯著的疏水性。經(jīng)自由基耦合步驟后，所得到的3種二聚體分子中都有一個(gè)4′位羥基得到再生而可再次被電化學(xué)氧化，這可解釋紫檀芪的初步氧化呈現(xiàn)兩個(gè)相距很近的氧化電流峰(圖1b)。

由上可知，在堿液中白藜蘆醇通過(guò)中心雙鍵斷裂生成了水溶性小分子產(chǎn)物，而紫檀芪則通過(guò)自由基偶合在電極表面生成不溶性二聚體。這種產(chǎn)物形態(tài)的差異得到了交流阻抗法實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，并可能與兩者的親脂性有關(guān)：紫檀芪的親脂性較強(qiáng)，初始氧化生成的自由基集中在油性碳糊電極表面上，便于自由基兩兩結(jié)合而快速轉(zhuǎn)化為二聚體產(chǎn)物，而白藜蘆醇的自由基則需經(jīng)歷較難進(jìn)行的中間雙鍵斷裂途徑。自由基中間體轉(zhuǎn)化得越快，越能拉動(dòng)式(1)所示的氧化步驟，從而增強(qiáng)抗氧化活性。

隨著pH值降低，白藜蘆醇羥基電離度減小，親脂性得到增強(qiáng)，抗氧化性也隨之增強(qiáng)(圖1a峰電流)。此外，當(dāng)采用不具油脂性的鉑電極時(shí)，測(cè)得的CV氧化電流密度比碳糊電極上小得多，電流峰形也很差。在石英光度池中進(jìn)行自然氧化時(shí)，反應(yīng)物的親脂性不能發(fā)揮作用，此時(shí)紫檀芪的氧化速率反比白藜蘆醇慢得多(比較圖5b和圖6b)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)揭示了紫檀芪在油脂性表面上的吸附富集作用遠(yuǎn)強(qiáng)于白藜蘆醇，并導(dǎo)致兩者抗氧化活性的差異。兩者的初始氧化都發(fā)生對(duì)位羥基上，通過(guò)一電子一質(zhì)子傳遞反應(yīng)生成苯氧自由基中間體。紫檀芪由于良好的親脂性，其自由基中間體易于兩兩耦合生成二聚體產(chǎn)物；而白藜蘆醇親脂性較差，特別是在堿液中，其自由基中間體需經(jīng)歷較難進(jìn)行的中間雙鍵斷裂途徑，轉(zhuǎn)化為可溶性小分子。氧化中間體快速轉(zhuǎn)化有利于增強(qiáng)抗氧化活性。紫檀芪較強(qiáng)的親脂性引起的富集作用以及氧化中間體的快速二聚化，是其具有較強(qiáng)抗氧化活性的重要原因。

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An Electrochemical Study of the Difference in Antioxidant Activity between Resveratrol and Pterostilbene

YU Mu-yang，ZHANG Meng，GAO Ling-feng，HE Jian-bo*
(Engineering Research Centre of Bio-process, Ministry of Education, School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The oxidation mechanisms oftrans-resveratrol and its derivative pterostilbene were studied to better understand the difference in antioxidant activity between the stilbene compounds. The effects of pH and accumulation time were examined by cyclic voltammetry, and the formation of oxidation products wasin situby thin layer UV-Vis spectroelectrochemistry. It was observed that adsorptive accumulation of pterostilbene on the oleaginous surface of the carbon paste working electrode was much stronger than that of resveratrol. The initial oxidation of both the stilbenes occurred at thep-hydroxyl groupviaone electron one proton transfer, forming phenoxy free radicals. The radical intermediates of pterostilbene might couple immediately to yield dimers at the electrode surface, while those of resveratrol, especially in the alkaline media, had to undergo the oxidative cleavage of the center double bond to produce soluble small molecules. Lipophilicity of pterostilbene superior to resveratrol might be the important reason for its higher antioxidant activity, since lipophilicity increases the adsorptive accumulation as well as accelerates the dimerization of the oxidized radical intermediates.

antioxidant activity；resveratrol；pterostilbene；cyclic voltammetry；in situspectroelectrochemistry

Q505

A

1002-6630(2012)05-0078-05

2011-05-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20972038)

余沐洋(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物電化學(xué)。E-mail：yumuyang415@163.com

*通信作者：何建波(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橛袡C(jī)與分析電化學(xué)。E-mail：jbhe@hfut.edu.cn