索 娜，周海蓮，王雪強，肖紅梅

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095）

常溫條件下拮抗酵母菌對葡萄果實的抗性誘導(dǎo)研究

索 娜，周海蓮，王雪強，肖紅梅*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095）

以從草莓果實上篩選的、對由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病具有較好抑制作用的葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）菌株為供試拮抗酵母菌，研究其對“巨峰”葡萄果實抗性的誘導(dǎo)。將葡萄果實分組，并分別進行噴灑和人工接入濃度為1×108cfu/mL的拮抗酵母菌懸液，常溫條件下貯藏，觀察果實感官品質(zhì)變化，并測定抗性相關(guān)酶酶活變化。結(jié)果表明，拮抗酵母菌處理不影響果實感官品質(zhì)，甚至可以較好地維持果實的感官品質(zhì)；人工接入的拮抗酵母菌可以較好的誘導(dǎo)果實的POD、PAL、CAT、PPO及APX的酶活，而對噴灑拮抗酵母菌的整個果實可以較好的誘導(dǎo)POD、SOD、PAL及APX的酶活。整體而言，拮抗酵母菌可引起果實的應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性。

葡萄有孢漢遜酵母，灰葡萄孢，酶活，抗性誘導(dǎo)

灰霉病是葡萄生產(chǎn)中最大的病害之一，發(fā)生普遍，并隨著設(shè)施栽培面積的擴大而日益嚴重。葡萄灰霉病不僅是生產(chǎn)田中常見病害更是產(chǎn)后儲藏過程中的毀滅性病害[1]。每年因灰霉病造成的葡萄產(chǎn)后損失最高可達50%，一般損失也達20%～30%[2]。因此，采取有效的防治方法防治葡萄灰霉病意義重大。葡萄采后灰霉病害的控制手段主要有臭氧處理[3]、化學(xué)殺菌劑[4]及生物防治[5-6]等。生物防治法（又稱生物保鮮技術(shù)）具有安全、無毒、對經(jīng)濟友好的特點[7]。生物保鮮技術(shù)主要包括微生物菌體及其代謝產(chǎn)物保鮮技術(shù)、生物天然提取物保鮮技術(shù)和利用遺傳基因的保鮮技術(shù)三方面。其中最受研究者重視的是微生物菌體及代謝產(chǎn)物保鮮技術(shù)，目前可用于拮抗的微生物種類有酵母菌、細菌、霉菌及放線菌等。酵母菌具有生長繁殖能力強、廣譜抗菌性、可與化學(xué)殺菌劑相容、不產(chǎn)生對人體有害的代謝物質(zhì)等優(yōu)點[8-9]，是拮抗微生物中最受關(guān)注的拮抗菌。目前，用于防治的常用拮抗酵母菌有畢赤酵母（Pichia membranifactien）[10]、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）[8-9]、羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）[11]等。但拮抗酵母菌對果蔬采后病害的防治效力與化學(xué)殺菌劑相比仍有較大的差距，大部分拮抗酵母菌的使用都處于實驗階段。為了實現(xiàn)拮抗酵母菌的商業(yè)化應(yīng)用，深入研究拮抗酵母菌的抑制機理顯得至關(guān)重要。本文選擇實驗室篩選出的對果蔬采后灰霉病具有較好抑制效果的葡萄有孢漢遜酵母作為研究主體，通過測定過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）六種抗性相關(guān)酶的酶活變化，探討常溫條件下拮抗酵母菌對果實抗性的誘導(dǎo)，為拮抗酵母的生物防治應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株

1.1.1.1 拮抗酵母菌 由本實驗室分離自草莓果實，經(jīng)過純化鑒定為葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）菌株，保持在4℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）斜面上。使用時用無菌接種環(huán)從斜面上取一環(huán)菌種劃線于PDA平板上，28℃下恒溫培養(yǎng)2d活化。

1.1.1.2 拮抗酵母菌懸浮液制備 用無菌接種環(huán)取一環(huán)活化后的菌種于裝有100m L馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose brothrmedium，PDB）的250m L三角瓶中，28℃條件下180r/min振蕩培養(yǎng)24h。血球計數(shù)板計數(shù)后，用無菌水配制成濃度為1×108cfu/m L的菌懸液，備用。

1.1.1.3 病原菌 灰葡萄孢霉，實驗室儲藏菌種。保持在4℃的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）斜面上。使用時用無菌接種環(huán)從斜面上取一環(huán)菌種劃線于PDA平板上，23℃恒溫培養(yǎng)7d活化。

1.1.1.4 病原菌孢子懸浮液制備 用無菌接種環(huán)取灰葡萄孢霉菌絲接種于PDA培養(yǎng)基平板上，23℃培養(yǎng)7d后，將少量無菌水注入平板中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，充分振蕩后用八層無菌紗布進行過濾取其濾液。用無菌水制備成1×105spore/m L的灰葡萄孢霉孢子懸液，備用。

1.1.2 供試果實 葡萄 清晨采摘于南京江心洲葡萄園，選擇大小一致、無病蟲害、無機械損傷、成熟度相似的“巨峰”葡萄。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA） 取新鮮去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水煮沸30m in，四層紗布過濾后，補充自來水，使濾液體積為1000m L，向濾液中加入20g葡萄糖和15～20g瓊脂，玻棒攪拌，溶解后分裝，于121℃濕熱滅菌30m in后存放備用。

1.1.3.2 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB） 不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，于121℃濕熱滅菌30m in后存放備用。

1.1.4 主要儀器 MC高速冷凍離心機 湘儀儀器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph；紫外可見分光光度計北京萊伯泰科儀器有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化；光學(xué)顯微鏡 尼康有限公司；HVE-50自動滅菌鍋 HIRAYAMA有限公司；SPX-150B-I型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 處理方法

以葡萄果實為寄主，在常溫條件下研究人工接種拮抗酵母菌與病原菌及噴灑拮抗酵母菌對葡萄果實抗性的誘導(dǎo)。將新鮮果實用2%NaClO溶液浸泡2m in，再用蒸餾水沖洗干凈，常溫下晾干并隨機分為4組，每組300個，備用。

打孔組：用無菌打孔器在果實腰部打大小為4mm（寬）×4mm（深）、相距1cm的兩個孔，形成傷口系統(tǒng)，常溫下晾干，一個孔內(nèi)接入10μL 1×108cfu/m L拮抗酵母菌菌懸液，另一孔內(nèi)接入10μL 1×105spore/m L病原菌孢子懸液。

打孔對照組：用無菌打孔器在果實腰部打大小為4mm（寬）×4mm（深）、相距1cm的兩個孔，形成傷口系統(tǒng)，常溫下晾干，一個孔內(nèi)接入10μL無菌水，另一孔內(nèi)接入10μL 1×105spore/m L病原菌孢子懸液。

噴灑組：用1×108cfu/m L拮抗酵母菌菌懸液噴灑整個葡萄果實。

噴灑對照組：用無菌水噴灑整個葡萄果實。

將4組果實常溫晾干，裝入套有保鮮袋的水果框內(nèi)，25℃貯藏。每隔24h觀察葡萄果實感官品質(zhì)變化，測定POD、SOD、PAL、CAT、PPO、APX的酶活。

1.3 感官品質(zhì)觀察

肉眼觀察葡萄果實表面顏色、病斑直徑，并用手觸摸葡萄果實感知其硬度的變化，評定經(jīng)不同處理后果實的感官品質(zhì)，從而從感官品質(zhì)的變化了解拮抗酵母菌處理果實的效果。

1.4 酶活測定方法

1.4.1 POD、SOD、APX、CAT酶活測定 從3顆去皮的葡萄上稱取1.5g葡萄果肉，放入預(yù)冷的研缽中，加入3m L 50mmol/L pH 7.8磷酸鹽緩沖液（1%PVP），冰水中研磨至勻漿，移至10m L離心管中，再加5m L緩沖液沖洗并移至移液管中，在4℃10000r/m in下冷凍離心15m in，取上清液為酶液，4℃冰箱中保存，備用。每個處理取4個樣。

POD活性測定：采后愈創(chuàng)木酚法[12]，以每分鐘在460nm處吸光值變化0.001為1個活性單位。

SOD活性測定：采用NBT光還原法[13]，以抑制反應(yīng)50%為一個酶活力單位。

CAT活性測定：參照范冬梅等[14]的方法，以反應(yīng)液每分鐘在240nm處吸光值變化0.001為一個酶活單位。

APX活性測定：參照Nakano等[15]方法進行，以每分鐘反應(yīng)液在290nm處吸光值變化0.001為1個酶活力單位。

1.4.2 PPO、PAL酶活測定 PPO酶液提?。簭?顆葡萄上稱取1.5g去皮葡萄果肉，放入預(yù)冷的研缽中，加入0.2mol/L pH 6.8磷酸氫二納-檸檬酸緩沖液，冰水中研磨至勻漿，移至10m L離心管中，再加5m L緩沖液沖洗并移至移液管中，在4℃10000r/m in下冷凍離心15min，取上清液為酶液，4℃冰箱中保存，備用。每個處理取4個樣。

PPO活性測定：采用鄰苯二酚比色法測定[16]，以反應(yīng)液每分鐘在398nm處吸光值變化0.001為1個酶活力單位。

PAL酶液提?。簭?顆葡萄上稱取1.5g去皮葡萄果肉，放入預(yù)冷的研缽中，加入硼酸緩沖液（0.1mol/L pH 8.8），冰水中研磨至勻漿，移至10m L離心管中，再加5m L緩沖液沖洗并移至移液管中，在4℃10000r/m in下冷凍離心15min，取上清液為酶液，4℃冰箱中保存，備用。每個處理取4個樣。

PAL活性測定：取甲、乙兩支試管，分別加入硼酸緩沖液（0.1mol/L，pH 8.8）3m L和苯丙氨酸1m L（0.02mol/L），甲試管加入1m L粗酶液，乙試管以1m L硼酸緩沖液作為空白對照。反應(yīng)液于37℃恒溫水浴中保溫60m in，立即加入0.2m l 6mol/L HCI溶液終止酶促反應(yīng)。隨后在290nm處測定吸光值，以每分鐘吸光值變化0.001為一個酶活性單位。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件，所有實驗數(shù)據(jù)用One-way ANOVA進行Duncan方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對果實感官品質(zhì)的影響

果實的感官品質(zhì)評定如表1所示。

表1 葡萄果實的感官品質(zhì)評定Table 1 Organoleptic quality of grape fruits evaluation

由表1可以看出，拮抗酵母菌處理對葡萄果實的感官品質(zhì)影響較小，但還是起到了一定的作用。因此，可以得出結(jié)論：拮抗酵母菌處理可以較好的保持葡萄果實的感官品質(zhì)。

2.2 對POD酶活的影響

圖1 拮抗酵母菌對葡萄果實傷口系統(tǒng)及整個果實的POD抗性酶活的誘導(dǎo)Fig.1 Effectof H.uvarum on POD activity of the inoculated and the whole grape fruit

如圖1所示，葡萄有孢漢遜酵母可以誘導(dǎo)整個葡萄果實的POD活性增加，人工接入拮抗酵母菌也可以誘導(dǎo)POD活性的增加。噴灑組在前2d的POD活性與對照組的活性沒有顯著性差異（p＜0.05），但第3d以后活性顯著高于對照組的活性。打孔組的果實POD活性一直顯著高于對照組的活性。對于四個組別，POD活性在貯藏過程中整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在第1d，打孔組別果實的POD活性遠遠大于噴灑組的POD活性，同時噴灑組及其對照組的峰值出現(xiàn)在第3d，而打孔組的峰值出現(xiàn)在第2d，且打孔的兩組果實的POD活性下降速度大于噴灑的兩組。分析上述現(xiàn)象的原因可能為：打孔組別對果實進行了破壞，在同樣貯藏條件下，衰老腐爛速度大于噴灑組的果實，因此導(dǎo)致其POD的峰值比噴灑組的提前1d，而且下降速度偏大。

2.3 對SOD酶活的影響

圖2 拮抗酵母菌對葡萄果實傷口系統(tǒng)及整個果實的SOD抗性酶活的誘導(dǎo)Fig.2 Effectof H.uvarum on SOD activity of the inoculated and the whole grape fruit

如圖2所示，所有組別果實的SOD活性都呈下降趨勢，而且打孔組的果實SOD活性下降速度高于噴灑組別果實活性下降速度。進行顯著性差異分析可以得出：在整個儲藏過程中，葡萄有孢漢遜酵母可以一直顯著誘導(dǎo)葡萄整個果實SOD活性，而對人工接入拮抗酵母菌的打孔組果實的SOD活性誘導(dǎo)不顯著，打孔組與打孔對照組僅在第2和第4d存在顯著性差異。

2.4 對APX酶活的影響

圖3 拮抗酵母菌對葡萄果實傷口系統(tǒng)及整個果實的APX抗性酶活的誘導(dǎo)Fig.3 Effectof H.uvarum on APX activity of the inoculated and the whole grape fruit

如圖3所示，葡萄有孢漢遜酵母可以誘導(dǎo)噴灑組別葡萄果實的APX活性增加，人工接入拮抗酵母菌也可以誘導(dǎo)果實APX活性的增加。對于噴灑組別，在第1d，噴灑組的APX活性與對照組的活性沒有顯著性差異（p＜0.05），但第2d以后活性顯著高于對照組的活性。對于打孔果實組別，APX的活性一直顯著高于對照組的活性。在整個貯藏過程中四個組別果實的APX活性在整體上均呈先上升后下降的趨勢，噴灑組及其對照組的峰值出現(xiàn)在第3d，而打孔組別的峰值出現(xiàn)在第2d，同時活性下降速度大于噴灑組。APX活性變化在整體上與POD活性變化相同。分析打孔組別酶活下降速度大于噴灑組別，可能原因為：打孔組別對果實進行了破壞，導(dǎo)致其衰老腐爛加快，而打孔組別峰值提前1d出現(xiàn)也可能是因為打孔傷口造成的。

2.5 對CAT酶活的影響

圖4 拮抗酵母菌對葡萄果實傷口系統(tǒng)及整個果實的CAT抗性酶活的誘導(dǎo)Fig.4 Effectof H.uvarum on CAT activity of the inoculated and the whole grape fruit

如圖4所示，所有組別果實的CAT活性都呈下降趨勢，而且打孔組別的果實CAT活性下降速度高于噴灑的整個果實CAT活性下降，噴灑組別果實的CAT活性始終維持在比較平穩(wěn)的狀態(tài)。進行顯著性差異分析可以得出：葡萄有孢漢遜酵母在整體上沒有顯著性的誘導(dǎo)葡萄整個果實CAT活性的增加，但人工接入拮抗酵母菌在前2d可以顯著性誘導(dǎo)CAT活性，隨著貯藏時間的延長，實驗組與對照組之間不存在顯著性差異。CAT的活性變化在整體上與上述SOD的活性變化相同。

2.6 對PAL酶活的影響

圖5 拮抗酵母菌對葡萄果實傷口系統(tǒng)及整個果實的PAL抗性酶活的誘導(dǎo)Fig.5 Effectof H.uvarum on PAL activity of the inoculated and the whole grape fruit

如圖5所示，所有組別果實的PAL活性都呈先上升后下降的趨勢，其中前3d PAL活性比較穩(wěn)定，第4d時所有組別活性急劇上升，尤其是噴灑組及打孔組，兩者的對照組上升趨勢相對緩慢。第4d之后，所有組別PAL活性開始下降，噴灑組的下降速度大于打孔組的果實下降速度。差異性分析結(jié)果顯示：噴灑組及其對照組在第1d時不存在差異性，但是第2d以后均存在顯著性差異，到第4d時差異性已達到極顯著（p＜0.01）；而打孔的兩個組別在前4d均存在顯著性差異，第5d時不存在顯著性差異。

2.7 對PPO酶活的影響

圖6 拮抗酵母菌對葡萄果實傷口系統(tǒng)及整個果實的PPO抗性酶活的誘導(dǎo)Fig.6 Effect of H.uvarum on PPO activity of the inoculated and the whole grape fruit

如圖6所示，所有組別的PPO活性呈下降趨勢，打孔組別PPO活性的下降速度大于噴灑，其原因為打孔組的果實上打有兩孔，加快葡萄果實的衰老腐爛。顯著性差異分析結(jié)果顯示：噴灑組與其對照組在前2d存在顯著性差異，但到第3d兩組之間沒有顯著性差異；而打孔組別的兩個組的酶活下降速度較快，但其顯著性差異一直維持到第4d結(jié)束，到第5d時，兩組之間沒有差異性。

3 討論與結(jié)論

POD、SOD、APX、CAT、PAL、PPO等酶是與植物抗病性有關(guān)的酶類，酶活的高低是植物抗病性強弱的一個重要生理特征[17]。植物在光合作用及受到逆境脅迫時會產(chǎn)生大量的氧自由基，大量氧自由基的積累會引起膜脂的過氧化、膜蛋白發(fā)生聚合等反應(yīng)，從而使生物膜的功能與結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，損傷植物細胞及機體[18]。提高植物體內(nèi)氧自由基代謝途徑的酶活力，可以使植物的抗氧化脅迫的能力增強。植物體內(nèi)可以消除氧自由基的酶包括SOD、POD、CAT、APX等[19]，它們相互協(xié)同作用可以保證寄主細胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而增強寄主的抗病性，延緩或阻止寄主細胞的衰老或死亡[20]。長期以來，PPO一直被認為是引起果蔬果實采后褐變的主要因素之一，同時可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用[21]。PAL是苯丙氨酸代謝的首要關(guān)鍵酶，與植物抗毒素的合成密切相關(guān)[22]。因此很多研究者研究果蔬果實這些酶活的變化來研究保鮮方法保鮮果蔬的機制[23-25]。

在研究常溫條件下葡萄有孢漢遜酵母對葡萄果實抗性誘導(dǎo)的實驗中，將拮抗酵母菌噴灑在整個果實上以及與灰葡萄孢一起人工接入葡萄果實上。其中將拮抗酵母與灰葡萄孢分別接入不同的傷口孔，是為了消除拮抗酵母菌與病原菌之間的直接相互作用而給結(jié)果帶來的影響。實驗結(jié)果表明：葡萄有孢漢遜酵母在較好保持果實感官品質(zhì)的同時又可以顯著性誘導(dǎo)整個果實的POD、SOD、PAL、APX酶活，但是對于CAT、PPO酶活的誘導(dǎo)效果不佳。而人工接入拮抗酵母菌可以顯著性誘導(dǎo)POD、PAL、APX、CAT、PPO酶活，但對SOD酶活的誘導(dǎo)效果不佳。

感官品質(zhì)通過觀察果實顏色、病斑直徑、硬度，分析描述拮抗酵母菌對果實感官品質(zhì)的實際影響，結(jié)果顯示，拮抗酵母菌處理對葡萄果實的感官品質(zhì)影響較小。

從整體而言，在常溫條件下葡萄有孢漢遜酵母可較好的保持果實的感官品質(zhì)，同時可以引起果實的應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性，從而提高果實對病原菌的抵抗能力。

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Research of resistance of grape fruits induced by antagonistic yeast under normal tem perature

SUO Na，ZHOU Hai-lian，WANG Xue-qiang，XIAO Hong-mei*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

The antagonistic yeast，Hanseniaspora uvarum，isolated from strawberry fruitand foundeffective against Botrytis cinerea was tested to the experiment to assay the antagonism in Jufeng g rape fruits.Grape fruits were divided into g roups.In some of the fruits two holes（one injected antagonistic yeast at the concentration of 1×108c fu/m L，another one injec ted B.cinerea at the concentration of 1×105spore/m L）were punched，and H.uvarum were sp rayed ac ross some of the whole fruits.Organolep tic quality of grape fruits was observed and enzyme activity of enzymes that related to resistance was measured under normal storage temperature. The result showed that antagonistic yeast had no influence on organolep tic quality of fruits，and could maintain the organolep tic quality of fruits.For the fruits punching two holes（one injec ted antagonistic yeast，another one injec ted B.cinerea），H.uvarum can be significant induced the activity of peroxidase（POD），phenylalanine ammonia lyase（PAL），ascorbate peroxidase（APX），catalase（CAT）and polyphenol oxidase（PPO）.For the whole fruits which sp rayed H.uvarum，H.uvarum could be significant induced the activity of POD，PAL，SOD and APX.Taken as a whole，antagonism yeast could trigger stress reaction of fruits，and induce resistance of host.

Hanseniaspora uvarum；Botrytis cinerea；enzyme activity；induced resistance

TS255.1

A

1002-0306（2012）22-0346-05

2012－06－01 *通訊聯(lián)系人

索娜（1990-），女，大學(xué)本科生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品儲藏加工。

江蘇省科技廳科技支撐計劃（BE2010385）。