趙小元，文鵬程，艾對元，楊 敏，梁 琪，米 蘭，張 炎，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

藏靈菇增殖條件的優(yōu)化

趙小元，文鵬程，艾對元，楊 敏，梁 琪，米 蘭，張 炎，張衛(wèi)兵*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

采用單因素實(shí)驗(yàn)、部分因素實(shí)驗(yàn)和中心組合設(shè)計對藏靈菇在復(fù)合培養(yǎng)基中的增殖條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和初始接種量對藏靈菇增殖的影響顯著，得到的最優(yōu)條件為：接種量1.1%、溫度23.2℃、初始pH6.48、培養(yǎng)時間22h時下，增殖率的預(yù)測極大值為263.04%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在該條件下藏靈菇增殖率為252.67%±4.54%。

藏靈菇，增殖，優(yōu)化

藏靈菇是一種白色或淺黃色的膠質(zhì)狀物質(zhì)，外形無規(guī)則，多為米粒、花椰菜和薄皮狀。藏靈菇常常被誤認(rèn)為是源自亞洲的紅茶菌和開菲爾粒，但它們在產(chǎn)品、菌相以及形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)上有一定差別[1-2]。具有活性的藏靈菇和開菲爾粒一樣可以在乳中生長繁殖，經(jīng)過長期培養(yǎng)，菇體會逐漸增大。藏靈菇是乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等的共生體，菇體含有水、粘性多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等[3-5]。藏靈菇發(fā)酵乳與普通發(fā)酵乳相比，含有更加豐富的蛋白質(zhì)、L（+）乳酸和B族維生素，同時藏靈菇中的益生菌對白色念珠菌、索氏志賀菌、傷寒沙門氏菌等病原微生物具有強(qiáng)烈的抑制作用。長期食用藏靈菇發(fā)酵乳可調(diào)節(jié)人體胃腸道中的菌群平衡，促進(jìn)食物的消化吸收、增強(qiáng)人體免疫力，此外還具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血壓、抗疲勞等多種生物學(xué)功效[6-7]。藏靈菇是具有復(fù)雜菌相的共生體，利用人工方法對藏靈菇中的菌種進(jìn)行復(fù)配的發(fā)酵劑制作的發(fā)酵乳很難達(dá)到天然藏靈菇酸乳的生理功效。目前，最常用的發(fā)酵方法仍是在乳中直接投放藏靈菇菇體或用其制作的種子液制成直投式凍干菌粉進(jìn)行發(fā)酵[8-9]，由于藏靈菇菇體在純牛奶培養(yǎng)基中增殖速度緩慢，嚴(yán)重制約了藏靈菇發(fā)酵乳的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而通過在培養(yǎng)基中添加營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)藏靈菇的快速增殖，同時培養(yǎng)基的更換時間、培養(yǎng)溫度、菇體的沖洗條件以及基本營養(yǎng)物濃度等因素都有可能影響藏靈菇的增殖[10-12]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藏靈菇在人工配制的復(fù)合培養(yǎng)基中增殖率與純牛奶培養(yǎng)基中相比有明顯增高[13]。本實(shí)驗(yàn)通過對藏靈菇在復(fù)合培養(yǎng)基中增殖條件的研究為藏靈菇發(fā)酵乳的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏靈菇（3號） 收集于甘肅甘南牧區(qū)一牧民家中（甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室保藏）；番茄 用料理機(jī)磨碎，在5000r/m in條件下離心5m in，上清液即為番茄汁；胡蘿卜 用擦絲器擦成細(xì)小的薄片，與蒸餾水按1∶1的比例加入料理機(jī)中磨碎，在10000r/min條件下離心7m in，上清液即為胡蘿卜汁；黃豆粉 按12%的比例加入牛奶中，在40℃水浴條件下攪拌使豆粉完全溶解，過濾得到豆奶；復(fù)合培養(yǎng)基 培養(yǎng)基由番茄汁、胡蘿卜汁和豆奶按3∶10∶12的比例配制而成[13]，115℃滅菌15m in；牛乳培養(yǎng)基 新鮮牛乳，115℃下滅菌15m in；檸檬酸 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純；氫氧化鈉 天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司，分析純。

YX-280 A高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SUPRA 22K超速真空離心機(jī) 韓國Inchun公司；PHS-3C數(shù)顯酸度計 雷磁分析儀器廠；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JYL-A010九陽料理機(jī) 九陽股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藏靈菇的活化 將低溫保藏的藏靈菇在30℃恒溫水浴鍋中解凍1h，過濾后用無菌水沖洗菇體，按5%（w/v）的接種量接入滅菌全脂乳培養(yǎng)基中，25℃條件下培養(yǎng)24h，用金屬網(wǎng)過濾，再次投入相同體積滅菌全脂乳培養(yǎng)基中，相同步驟活化6次[14-15]。

1.2.2 藏靈菇增殖率的測定 藏靈菇培養(yǎng)過程中濾出藏靈菇不進(jìn)行沖洗，培養(yǎng)完成后用無菌水洗凈，用無菌濾紙吸干粘附在表面的水分后稱重，用下式計算藏靈菇的增殖率：

式中：Z為藏靈菇增殖率（%）；M為培養(yǎng)后藏靈菇的質(zhì)量（g）；m為初次接種時藏靈菇的質(zhì)量（g）。

1.2.3 培養(yǎng)條件對藏靈菇增殖的影響

1.2.3.1 初始pH對藏靈菇增殖的影響 以1%的接種量將藏靈菇接種于初始pH分別為6.18、6.28、6.38、6.48、6.58的培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)22h后過濾，更換培養(yǎng)基并連續(xù)培養(yǎng)五批后稱重，計算其增殖率。

1.2.3.2 接種量對藏靈菇增殖的影響 分別以1%、3%、5%、7%、9%的接種量將藏靈菇接種于初始pH 6.48的培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)22h后過濾，更換培養(yǎng)基并連續(xù)培養(yǎng)五批后稱重，計算其增殖率。

1.2.3.3 溫度對藏靈菇增殖的影響 以1%的接種量將藏靈菇接入初始pH 6.48的復(fù)合培養(yǎng)基中，分別在18、23、28、33、38℃培養(yǎng)22h后過濾，更換培養(yǎng)基并連續(xù)培養(yǎng)五批后稱重，計算其增殖率。

1.2.3.4 培養(yǎng)時間對藏靈菇增殖的影響 以1%的接種量將藏靈菇接入初始pH 6.48的復(fù)合培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)16、19、22、25、28h后過濾，更換培養(yǎng)基并連續(xù)培養(yǎng)五批后稱重，計算其增殖率。

1.2.4 藏靈菇增殖條件的優(yōu)化 采用部分因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計（Fractional Factorial Design），確定影響藏靈菇增殖的主要因素。部分因素設(shè)計因素水平表如表1所示。

表1 部分因素設(shè)計因素水平表Table 1 Levels and codes of variables of fractional factorial design（FFD）

利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定出中心組合設(shè)計（Central Composite Design）的中心點(diǎn)，最后通過中心組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化藏靈菇的增殖條件[16-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對藏靈菇增殖的影響

由圖1可見，pH、接種量、溫度、培養(yǎng)時間等培養(yǎng)條件對藏靈菇的增殖均有一定影響。初始pH為6.18～6.48之間時，藏靈菇的增殖率呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，當(dāng)pH達(dá)到6.48時藏靈菇增殖率最大，達(dá)到213.72%，隨后增殖率開始變小。這主要是由于pH過高或過低會抑制菇體中固有菌群的生長，從而影響到菇體的增殖。藏靈菇增殖最佳pH為6.48，與新鮮牛乳初始pH 6.5～6.7接近，這是由于在pH 6.48時，培養(yǎng)基擁有最優(yōu)的離子環(huán)境，通過滅菌后營養(yǎng)物質(zhì)能夠較好地保存，因而更有利于藏靈菇的生長繁殖。

在培養(yǎng)過程中，隨著藏靈菇接種量不斷增大增殖率逐漸降低。接種量為1%時，藏靈菇的增殖率最大，達(dá)到196.43%。藏靈菇增殖率隨著接種量的增加而減少，可能是由于接種量菇體增多時，微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭性增強(qiáng)引起的。Dem irhan等[4]研究開菲爾粒時發(fā)現(xiàn)，隨著開菲爾粒接種量的增加（2.5%～10%），其增殖率也呈下降趨勢。

不同溫度培養(yǎng)時藏靈菇的增殖率有較大差別，溫度過低或過高都會影響菇體的增殖，在23℃培養(yǎng)時增殖率最高。這主要是因?yàn)闇囟冗^低會導(dǎo)致藏靈菇中的微生物生長速度減緩，而溫度過高會使菇體中乳酸菌的快速繁殖，引起乳酸的迅速積累，培養(yǎng)基pH迅速下降，不利于其他微生物的生長[12]。Demirhan等[4]研究開菲爾粒增殖時也發(fā)現(xiàn)溫度對其生長影響較大，其最適培養(yǎng)溫度為25℃。Gorsek和Tramsek[11]報道了另一種開菲爾粒在24℃條件下增殖率最大。

藏靈菇培養(yǎng)16～22h時其增殖率隨時間的延長逐漸增大，22h后開始緩慢下降，這可能是由于培養(yǎng)后期培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致復(fù)合微生物群整體活性下降，從而使得藏靈菇增殖率下降。Dem irhan等[4]研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長，開菲爾粒的增殖率呈下降趨勢，并在20h后幾乎不增長，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。

圖1 培養(yǎng)條件對藏靈菇增殖的影響Fig.1 Effectof the culture condition on Tibetanmushroom proliferation

2.2 藏靈菇增殖條件的優(yōu)化

2.2.1 部分因素實(shí)驗(yàn) 部分因素設(shè)計因素水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用部分因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計法考察各因素水平對藏靈菇增殖的影響程度，實(shí)驗(yàn)及分析結(jié)果分別見表2、表3?；貧w分析表明模型的R2=0.9927，說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計能夠較好模擬藏靈菇培養(yǎng)過程中各因素對其增殖率的影響。其中溫度（p＜0.0001），接種量（p＜0.0001）是兩個關(guān)鍵的影響因素，由表3回歸分析方程系數(shù)可知，溫度的系數(shù)顯著性為正，接種量的系數(shù)顯著性為負(fù)，這表明升高溫度和減少接種量對藏靈菇增殖有利；二者都在99.9%的概率水平上差異極顯著，而其他因素對藏靈菇增殖率的影響均差異不顯著，因而選擇溫度和接種量兩個因素作為后續(xù)的研究對象。

表2 部分因素設(shè)計及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of FFD

表3 部分因素設(shè)計對藏靈菇增殖率的回歸分析結(jié)果Table 3 Results of FFD regression analysis for Tibetanmushroom increase

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)表3中參數(shù)分析值，代表溫度的變量X1和代表接種量的變量X2為藏靈菇增殖的主要影響因素，X1為正值，X2為負(fù)值。因而選擇X1和X2進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，以確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。代表pH的變量X3和代表培養(yǎng)時間的變量X4固定在中心點(diǎn)水平。

針對X1和X2設(shè)計最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果如表4所示。隨著溫度升高、接種量下降的同時，增值率持續(xù)增加，在第5組實(shí)驗(yàn)中達(dá)到最高值239.95%，之后又開始下降，因此以溫度23℃，接種量1%作為中心組合設(shè)計的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果Table 4 Design and results of the steepestascent

2.2.3 中心組合實(shí)驗(yàn) 以爬坡實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果作為中心點(diǎn)，以溫度（X1）和接種量（X2）作為自變量、藏靈菇的增殖率（Y）作為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計對其進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素水平及結(jié)果見表5。

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計及響應(yīng)值結(jié)果Table 5 Test design and results of central composite design

利用Design Expert 7.0擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到回歸方程：Y=262.00+15.68X1+6.83X2+6.42X1X2-83.45X12-45.38X22。

回歸方程在α=0.01水平上顯著，因而回歸方程對實(shí)驗(yàn)擬合情況很好。該模型的相關(guān)系數(shù)為R2= 0.9250，表明92.5%的藏靈菇增殖率可由該模型解釋。從表6的中心組合方差分析中可以發(fā)現(xiàn)，溫度（X1）和接種量（X2）的p值都大于0.05，該模型不是線性模型。同時溫度和接種量的交互作用（p=0.65）也不顯著，但X12（p＜0.001）在99.99%的概率水平上對響應(yīng)值的影響顯著，X22（p=0.01）在99%的概率水平上對響應(yīng)值的影響顯著。以溫度和接種量作為平面坐標(biāo)，以藏靈菇增殖率作為響應(yīng)值，繪出計算的三維響應(yīng)圖，證實(shí)了擬合曲面有極大值，見圖2。對回歸方程求導(dǎo)，得到極大值為263.04%，對應(yīng)的接種量為1.02%，溫度為23.19℃。為方便稱取藏靈菇，接種量定為1.1%，為方便設(shè)定溫度，定為23.2℃，在這一條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，藏靈菇三次重復(fù)的增殖率分別為248.72%、251.76%、257.80%，平均增殖率為252.67% ±4.54%，與模型預(yù)測值接近，說明該數(shù)學(xué)模型對藏靈菇增殖率的預(yù)測較為準(zhǔn)確。

表6 中心組合試驗(yàn)方差分析Table 6 Analysis of variance for CCD

圖2 中心組合設(shè)計響應(yīng)面圖Fig.2 Surface plotof CCD

3 結(jié)論

影響藏靈菇增殖的因素有很多，本實(shí)驗(yàn)通過部分因素設(shè)計實(shí)驗(yàn)確定對藏靈菇增殖影響最顯著的兩個因素為溫度和接種量；通過中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析對藏靈菇在復(fù)合培養(yǎng)基中的增殖條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)條件為初始pH6.48、接種量1.1%、溫度23.2℃、培養(yǎng)時間22h時，獲得藏靈菇的最大增殖率為252.67%±4.54%。

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Optim ization of the proliferative condition of Tibetan mushroom

ZHAO Xiao-yuan，WEN Peng-cheng，AIDui-yuan，YANG M in，LIANG Qi，M ILan，ZHANG Yan，ZHANG W ei-bing*
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Using sing le factor experiment，fractional factorial experiment and central com posite design to op tim ize the p roliferative cond ition of Tibetan mushroom in compound media，the result showed that tem perature and inoculation amount had significant effec ts on the p roliferation of Tibetan mushroom.The op timal condition as follows：when inoculation amount of 1.1%（w/v），tem perature of 23.2℃，initial pH6.48 and rep lacing time ofmed ium 22h，the p red iction of the maximum value was 263.04%.The result of verification test showed that the p roliferative rate of Tibetanmushroom would be 252.67%±4.54%under the cond ition.

Tibetan mushroom；p roliferation；op tim ization

TS201

A

1002-0306（2012）20-0238-04

2012－04－23 *通訊聯(lián)系人

趙小元（1987-），男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物。

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2012GB2G100461）；蘭州市科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊培育計劃項(xiàng)目（2011-1-144）。