魏冉冉，方 偉，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶中乳酸菌多態(tài)性分析

魏冉冉，方 偉，霍貴成*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

以從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市牧區(qū)采集的1份傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶樣品為研究對象，對其進(jìn)行乳酸菌的分離鑒定。通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)法分離出17株菌，并對17株菌進(jìn)行16S rDNA序列分析、多位點pheS序列分析和生理生化鑒定，鑒定的結(jié)果為11株乳酸乳球菌乳酸亞種、1株格式乳球菌、1株糞腸球菌、2株植物乳桿菌植物亞種及2株彎曲乳桿菌。乳酸乳球菌乳酸亞種為優(yōu)勢菌（占總分離菌株的64.7%）。

酸牛奶，乳酸菌，多態(tài)性

內(nèi)蒙古地區(qū)牧民長期飲用的酸牛奶，就是以鮮牛奶為原料，未經(jīng)任何處理在自然環(huán)境中發(fā)酵而成的乳制品。發(fā)酵的過程不需要商品發(fā)酵劑，而是用前一天的酸奶做天然發(fā)酵劑接種到新鮮的奶中使其自然發(fā)酵成酸奶，其味清酸爽，開胃增食，是農(nóng)牧民野外、農(nóng)耕、放牧的理想食品。常和奶油混合用來拌炒米或其他米飯吃。如加入少許白糖，夏季尤為酸甜可口，為牧區(qū)夏季日常飲用食品之一[1]。由于其是自然發(fā)酵，未經(jīng)任何處理，因此其微生態(tài)環(huán)境未遭破壞，而且由于它特殊的制作方法使其形成了自己的特色，使其中的乳酸菌的生物學(xué)特性和基因多樣性得到了很好的保留，因此這些豐富的乳酸菌資源有待于開發(fā)和利用。對這些乳酸菌進(jìn)行分離鑒定和生物學(xué)特性的研究，對傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌種類的認(rèn)識、推動乳酸菌的基礎(chǔ)研究以及開發(fā)應(yīng)用地域特色的乳酸菌制品都有重要意義。本研究以從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市牧區(qū)采集的1份傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶樣品為研究對象，對其中的乳酸菌多樣性進(jìn)行了研究，不僅能夠研究牧區(qū)獨(dú)特自然發(fā)酵乳中微生物區(qū)系組成，而且能為進(jìn)一步開發(fā)利用內(nèi)蒙古自治區(qū)牧民自制酸牛奶中的乳酸菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 采自內(nèi)蒙古呼倫貝爾市牧民家庭自制的1份傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛乳；乳酸菌富集用加富的脫脂乳培養(yǎng)基 10%脫脂乳、0.5%蛋白胨、0.25%酵母粉、1%葡萄糖[2]；分離培養(yǎng) 采用MRS培養(yǎng)基分離乳酸桿菌和M 17培養(yǎng)基分離乳酸球菌[3]；做生理生化實驗所用的各種糖發(fā)酵實驗的培養(yǎng)基 均為青島海博有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管。

光學(xué)顯微鏡（OLMPUS）、蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、PCR儀，凝膠成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集 采集牧民家庭中的傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛乳于滅菌管中，并封好放入冰盒內(nèi)，帶回實驗室于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌的分離、純化與保存 樣品→富集培養(yǎng)→涂布（稀釋度為10-5、10-6）→挑取可疑菌落→液體培養(yǎng)基培養(yǎng)→平板劃線分純（分純?nèi)危兣囵B(yǎng)物→革蘭氏染色（G+）；過氧化氫實驗（-）→甘油保存（-80℃）（50%的甘油，菌液∶甘油為6∶4）。

1.2.3 菌株基因組DNA小量提取 取1m L MRS或M 17液體培養(yǎng)物（過夜培養(yǎng)或培養(yǎng)24h），10000r/m in離心1m in，收集菌體。采用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA置于-20℃保存。提取的DNA作為16S rDNA序列分析，多位點pheS序列分析的樣品。

1.2.4 16S rDNA序列分析 利用引用通用引物27F和1541R[4-5]對菌株的16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物為1541R：5’-AAGGAGGTGATTCCAGCC-3’。

擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5m in；30個循環(huán)：94℃變性1m in，58℃退火1m in，72℃延伸2m in；72℃末端延伸10m in，然后將擴(kuò)增成功的產(chǎn)物直接送華大純化和測序。參比序列采用乳酸菌已知模式菌株的16S rDNA序列（這些序列從GeneBank中獲取）[6]。序列的對比和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建都通過Mega 4軟件（Tamura，et al，2007）[7]完成。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用鄰比法[8]和maximum composite likelihood model模型。自展分析基于1000次重復(fù)。

1.2.5 pheS基因序列分析[9]利用引物pheS-21-F和pheS-23-R對菌株的pheS基因序列片段進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為pheS-21-F：5’-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3’，反向引物為pheS-23-R：5’-GGRTGRACCATVCC NGCHCC-3’。

擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5m in；30個循環(huán)：94℃變性1min，46℃退火1min 15s，72℃延伸1min 15s；72℃末端延伸7m in，然后將擴(kuò)增成功的產(chǎn)物直接送華大純化和測序。參比序列采用乳酸菌已知模式菌株的pheS（這些序列從GeneBank中獲取）。序列的對比和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建都通過Mega 4軟件完成。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用鄰比法和maximum composite likelihood model模型。自展分析基于1000次重復(fù)。1.2.6 乳酸菌的生理生化鑒定 鑒定乳酸乳球菌，需要做40℃生長實驗、4%NaCl生長實驗、pH 9.2生長實驗和糖發(fā)酵實驗。糖發(fā)酵實驗利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，將活化好的菌液離心后，用生理鹽水重新懸浮，注入管內(nèi)，再放入滅菌大試管中，37℃培養(yǎng)一周后觀察結(jié)果。實驗鑒定結(jié)果均參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[10]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，確定其屬種。

2 結(jié)果與討論

2.1 各菌株16S rDNA序列分析

各菌株的序列分析結(jié)果總結(jié)在樹狀圖中（見圖1）。

菌株KLDS 6.1101與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，有99.9%的16S rDNA序列相似性。因而菌株KLDS 6.1101可以初步鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

圖1 基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA alignment

圖2 基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA alignment

菌株KLDS 4.1112與格式乳球菌（Lactococcus garvieae）系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，有99.9%的16S rDNA序列相似性，因而菌株KLDS 4.1112可以初步鑒定為格式乳球菌（Lactococcus garvieae）。由此樹狀圖可以看出乳酸乳球菌形成單一的DNA同源群，但是按照表型特征足可以將它們分為三個亞種，它們是Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactis subsp.hordniae和Lactococcus lactis subsp.lactis。菌株KLDS 4.1101、KLDS 4.1102、KLDS 4.1103、KLDS 4.1104、KLDS 4.1105、KLDS 4.1106、KLDS 4.1107、KLDS 4.1108、KLDS 4.1109、KLDS 4.1110、KLDS 4.1111屬于乳酸乳球菌，它們與Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactis subsp.hordniae、Lactococcus lactis subsp.lactis的16S rDNA序列相似性都在99%以上。本實驗的結(jié)果也說明了很難通過16S rDNA全序列測定的方法將它們區(qū)分出來，因此它們進(jìn)一步的分離可以根據(jù)生理生化實驗的結(jié)果。

菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102屬于植物乳桿菌（L.p lantarum）組，與Lactobacillus p lantarum subsp. argentoratensis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus p lantarum subsp.p lantarum、Lactobacillus parap lantarum和Lactobacillus fabifermentans系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切，分別有99.6%、99.7%、99.6%、99.7%和99.0%的16S rDNA序列相似性，可以初步鑒定為植物乳桿菌（L.p lantarum），其確切的分類地位還需要其他分類學(xué)方法才能確定。

圖3 基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA alignment

菌株KLDS 1.1103和KLDS 1.1104屬于彎曲乳桿菌（L.curvatus）組，與Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus graminis、Lactobacillus sakei 和Lactobacillus curvatus系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切，分別有98.0%、99.4%、99.0%和99.6%的16S rDNA序列相似性，除了Lactobacillus fuchuensis外，菌株KLDS 1.1103和KLDS 1.1104與其他三個菌種的16S rDNA序列相似性都很高，菌株KLDS 1.1103和KLDS 1.1104可以初步鑒定為彎曲乳桿菌（L.curvatus），其確切的分類地位還需要其他分類學(xué)方法才能確定。

2.2 pheS基因序列分析

菌株KLDS 1.1101和KLDS1.1102與Lactobacillus p lantarum subsp.argentoratensis、Lactobacilluspentosus、Lactobacillus p lantarum subsp.plantarum、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus fabifermentans的16S rDNA序列相似性都很高，因此在16S rDNA序列分析的基礎(chǔ)上，通過pheS基因序列進(jìn)一步對菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102的分類地位進(jìn)行確定。

圖4 基于pheS基因序列樹狀圖Fig.4 Phylogenetic tree based on the pheSgene alignment

菌株KLDS 1.110和KLDS 1.1102與Lactobacillus p lantarum subsp. argentoratensi、 Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum subsp.plantarum、Lactobacillus parap lantarum 和 Lactobacillus fabifermentans分別有90%、80.3%、100%、89.5%和77.7%pheS序列相似性，因此菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102鑒定為植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus p lantarum subsp.p lantarum）。

2.3 乳酸乳球菌生理生化鑒定結(jié)果

乳酸菌種的鑒定主要是分離菌株對碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)酸實驗，即通過對單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來區(qū)分[10-12]。對于某些球菌還有pH 9.2、4%NaCl和40℃的生長實驗。對菌株KLDS 4.1101、KLDS 4.1102、KLDS 4.1103、KLDS 4.1104、KLDS 4.1105、KLDS 4.1106、KLDS 4.1107、KLDS 4.1108、KLDS 4.1109、KLDS 4.1110、KLDS 4.1111進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定項目和結(jié)果如表1所示，11株乳酸乳球菌能發(fā)酵半乳糖、乳糖、麥芽糖和核糖，不能發(fā)酵松三糖、蜜二糖和棉籽糖，能在pH 9.2、4%NaCl和40℃條件下生長，其結(jié)果和《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[10]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]中描述的乳酸乳球菌乳酸亞種的生理生化結(jié)果一致，因此將11株菌鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種。

3 結(jié)論

3.1 從傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶中分離和純化了17株乳酸菌，對這17株乳酸菌進(jìn)行16S rDNA全序列分析，可以初步將這些菌株鑒定為以下乳酸菌種：11株乳酸乳球菌、1株格式乳球菌、1株糞腸球菌、2株植物乳桿菌和2株彎曲乳桿菌。

表1 乳酸乳球菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of physiological and biochemical test of lactococcus lactis

3.2 對菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102的確切的分類地位通過pheS序列分析進(jìn)行了確定，可將菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102鑒定為植物乳桿菌植物亞種。用16S rDNA全序列分析和生理生化相結(jié)合將菌株KLDS 4.1101、KLDS 4.1102、KLDS 4.1103、KLDS 4.1104、KLDS 4.1105、KLDS 4.1106、KLDS 4.1107、KLDS 4.1108、KLDS 4.1109、KLDS 4.1110、KLDS 4.1111鑒定到亞種，這些菌株均為乳酸乳球菌乳酸亞種。

3.3 內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶中的乳酸菌種類和數(shù)量有所不同，呈現(xiàn)出多樣性，其中乳酸乳球菌乳酸亞種為優(yōu)勢菌占總分離菌的64.7%，可能正是它們賦予了酸牛奶特殊的風(fēng)味和質(zhì)地。

[1]劉計民.內(nèi)蒙古傳統(tǒng)風(fēng)味民族乳食品簡介[J].中國乳品工業(yè)，1993，21（5）：237-240.

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Diversity analysis of lactic acid bacteria isolated from the traditional fermented m ilk

WEIRan-ran，F(xiàn)ANGW ei，HUO Gui-cheng*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

17 isolates of lactic acid bac teria（LAB）were isolated from the trad itional fermented m ilk gathering from the herdmen’s home in Hulunbeier of Inner Mongolia by traditional pure culture method.Based on 16S rDNA sequence analysis，pheS sequence analysis and physiological and biochem ical test，these isolates were identified as 11 strains of Lactococcus lactic.subsp.lactic，1 strain of Lactococcus garvieae，1 strain of Enterococcus faecalis，two strains of Lactobacillus p lantarum subsp.p lantarum and 2 strains Lactobacillus curvatus.Lactococcus lactic.subsp.lactic was the p redom inant strain（64.7%of the total isolates）.

fermented m ilk；lactic acid bacteria；d iversity

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0210-04

2012－05－21 *通訊聯(lián)系人

魏冉冉（1986-），女，碩士研究生，研究方向：乳品科學(xué)與微生物。

“乳酸菌代謝調(diào)控與發(fā)酵劑制造技術(shù)”教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃資助（IRT0959）。