張麗平，盧紅梅，*，彭湘屏，戴 銳

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550003；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽 550003）

淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究

張麗平1，2，盧紅梅1，2，*，彭湘屏1，2，戴 銳1，2

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550003；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽 550003）

主要對淋澆發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、純度、持水性、孔隙度和熱重特性進行了研究，將其與靜態(tài)和搖瓶培養(yǎng)方式得到的細(xì)菌纖維素進行了比較。結(jié)果表明，培養(yǎng)方式不同，細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)、合成模式和微觀結(jié)構(gòu)都不相同；淋澆發(fā)酵法得到的細(xì)菌纖維素的-OH締合度、聚合度、純度、持水性、孔隙度、熱穩(wěn)定性均高于靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素和搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素，但結(jié)晶度和晶體粒度小于靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素，大于搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素。

細(xì)菌纖維素，淋澆發(fā)酵，結(jié)構(gòu)，性質(zhì)

與植物和動物纖維素相比，細(xì)菌纖維素具有高純度、高結(jié)晶度、高聚合度、高持水性和高復(fù)水性等獨有的優(yōu)良性質(zhì)[1]，在傳統(tǒng)食品、食品基料、低肉腸、發(fā)酵香腸和茶飲料中都有廣泛的應(yīng)用，是目前最具發(fā)展前景的生物基礎(chǔ)和納米生物材料[2]。淋澆發(fā)酵法的生產(chǎn)設(shè)備是淋澆塔，液體培養(yǎng)基從塔頂加入，可與填料層充分接觸，淋澆發(fā)酵法低剪切力和高溶氧量且可控的優(yōu)勢主要依靠填料吸附菌種和淋澆回流增氧兩大工藝來實現(xiàn)。在淋澆發(fā)酵過程中，菌種吸附于填料之上，為細(xì)菌纖維素的合成提供了充足的三維空間，細(xì)菌纖維素的形成過程與靜態(tài)和搖瓶培養(yǎng)時可能有所不同。因此，對淋澆發(fā)酵法生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素的性能進行研究，同時與靜態(tài)和搖瓶培養(yǎng)方式進行比較，可以為其今后在食品及材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木醋桿菌（Acetobacter xylinum） 貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室保藏；纖維素酶酶活為10，000U/g 日本Yakult公司；培養(yǎng)基 蔗糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，蒸餾水1000m L，pH自然；銅氨溶液 每100m L溶液中，銅1.30g，氨15.00g，氫氧化鈉0.70g，蔗糖0.20g。

淋澆發(fā)酵塔 德國貝朗國際生物工程公司；S-3400N掃描電鏡 云南金諾科技有限公司；NICOLET 5700 FT-IR顯微紅外光譜儀 山東三瑞科技有限公司；烏氏粘度計 毛細(xì)管直徑為0.80mm，上海天平儀器廠；SMART APEXⅡ單晶衍射儀 德國Bruker公司；NETZSCH STA 449C熱重質(zhì)譜（TG-MS）分析儀

德國耐馳公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 分別準(zhǔn)確量取50m L發(fā)酵培養(yǎng)基置于250m L三角瓶中，121℃下滅菌20m in，冷卻后在無菌條件下補加1m L無水乙醇，接入木醋桿菌種子液10%（5m L），將一部分裝有50m L發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶置于30℃下靜置培養(yǎng)，將另一部分裝有50m L發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶置于30℃、150r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)144h。

淋澆發(fā)酵培養(yǎng)：準(zhǔn)確量取8L發(fā)酵培養(yǎng)基加入經(jīng)沸水消毒30m in的淋澆發(fā)酵塔中，將121℃下滅菌的玉米芯5kg趁熱轉(zhuǎn)移至淋澆發(fā)酵塔假底之上，蓋好頂蓋后強制冷卻至35℃后進一步自然冷卻至30℃，然后按10%（v/v）接種量迅速接入培養(yǎng)好的種子液，靜置培養(yǎng)12h后，每隔2h淋澆一次，直至發(fā)酵結(jié)束（144h），整個過程采用33℃左右的溫水進行控溫，使塔內(nèi)溫度維持在28～31℃。

1.2.2 細(xì)菌纖維素的分離純化方法 靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素的分離純化參照文獻[3]；搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素的分離純化是將發(fā)酵液集于離心管中在4000r/min下離心15m in得細(xì)菌纖維素沉淀，后續(xù)處理同文獻[3]；淋澆發(fā)酵細(xì)菌纖維素的分離純化是將細(xì)菌纖維素膜從玉米芯上小心撕下，后續(xù)處理同文獻[3]。

1.2.3 樣品制備 細(xì)菌纖維素膜的制備：將細(xì)菌纖維素濕膜平鋪于平板上于105℃下烘干至恒重；細(xì)菌纖維素粉末的制備：取適量烘干的細(xì)菌纖維素膜于清潔研缽中充分研磨。

1.3 分析方法

聚合度的測定采用烏氏粘度計法[4]。

純度分析采用將含纖維素酶的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的上清液加入到纖維素粉末中，再烘干稱重的方法[5]。

持水性分析：將細(xì)菌纖維素濕膜稱重后放入105℃烘箱中烘干，稱其重量，再將其放入常溫水中直到纖維素膜不再吸水為止，取出稱重。

式中，Mw代表濕膜的質(zhì)量；Md代表干膜的質(zhì)量；Mwr代表復(fù)水膜的質(zhì)量。

孔隙度分析：將上述復(fù)水膜采用細(xì)線系捆，采用文獻[6]中的裝置，稱量其懸浮在水中的質(zhì)量，記為Mww[7]，則：

式中，Mw代表濕膜的質(zhì)量；Md代表干膜的質(zhì)量；Mwr代表復(fù)水膜的質(zhì)量。

1.4 檢測方法

1.4.1 掃描電鏡（SEM） 將細(xì)菌纖維素干膜用噴金鍍膜后利用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，電壓25kV。

1.4.2 傅里葉紅外光譜 將經(jīng)提純后的細(xì)菌纖維素薄膜自然干燥，測試其紅外光譜，450mW，1064nm掃描范圍400～4000cm-1，設(shè)定分辨率4cm-1，掃描速度為0.2cm/s，掃描次數(shù)為16次，室溫下操作。

1.4.3 X-射線衍射 將細(xì)菌纖維素干膜平整固定在樣品架上，銅靶，測試電壓40kV，測試電流l00mA，速率5°/m in，步寬0.02°，2θ為0～80°大范圍掃描。根據(jù)X衍射參數(shù)，由下面兩個計算公式分別計算細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度（Xc）和晶體的粒徑L[8-9]。

式中，I代表衍射峰的衍射強度；Iam代表無定形區(qū)衍射強度；β代表半峰寬（rad）；k代表常數(shù)，通常取

0.89；λ代表X射線波長（0.15406nm）；θ代表布拉格衍射角。

1.4.4 熱重質(zhì)譜分析 適量稱取細(xì)菌纖維素干膜樣品，利用STA 449C熱分析儀，N2氛圍，以10℃/min的升溫速率從20℃升溫至800℃[10]，觀察樣品質(zhì)量隨溫度的變化情況，得到TG-DSC曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 外觀形態(tài)

三種培養(yǎng)方式下獲得的細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)有所不同，其中淋澆發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Tr-BC）貼于玉米芯表面生成，呈不規(guī)則片狀薄膜，每片薄膜的厚度不一；靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)菌纖維素（St-BC）為層狀薄膜，膜的形態(tài)取決于發(fā)酵容器的形狀，膜的厚度相對均勻；搖瓶培養(yǎng)細(xì)菌纖維素（Ag-BC）表現(xiàn)為薄絲帶狀。

2.2 微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電子顯微鏡觀察三種培養(yǎng)方式下獲得的細(xì)菌纖維素的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素SEM圖Fig.1 SEM figure of bacterial cellulose in different cultivationmethods

表1 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素紅外光譜分析結(jié)果Table 1 Infrared spectral analysis results of bacterial cellulose in different cultivationmethods

放大倍數(shù)為2000倍時，觀察細(xì)菌纖維素膜的表面結(jié)構(gòu)，可以看出Tr-BC表面粗糙，纖維絲并不完全表現(xiàn)為同一平面內(nèi)的交織排列，也表現(xiàn)出了垂直伸展，這說明Tr-BC能以三維的模式合成。相對而言，St-BC呈層狀，而Ag-BC呈層層包裹的球形。放大倍數(shù)為20，000倍時，觀察細(xì)菌纖維素膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可以看出三種細(xì)菌纖維素均為纖維絲帶相互交織而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且纖維絲帶粗細(xì)相當(dāng)（20～65nm），但Tr-BC和St-BC的網(wǎng)狀更加緊密，而Ag-BC的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相對疏松。這說明了培養(yǎng)方式對細(xì)菌纖維素的微觀結(jié)構(gòu)有較大影響。

圖2 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of bacterial cellulose from different cultivationmethods

2.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.3.1 紅外光譜分析 三種細(xì)菌纖維素樣品紅外光譜分析結(jié)果如表1和圖2所示，吸收峰1、12、13、14證實了樣品中大量—OH的存在；吸收峰3、7、8、17、18證實了—CH2—、＞CH—和C—H的存在；吸收峰9、16證實了環(huán)C—O—C的存在；吸收峰10、15證實了直鏈C—O—C的存在。以上結(jié)果顯示為細(xì)菌纖維素葡聚糖的特征吸收，可以推斷出三種樣品的主要成分均為細(xì)菌纖維素。由圖2可以看出，三者的圖譜基本一致，說明淋澆發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Tr-BC）、靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素（St-BC）、搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Ag-BC）的化學(xué)組成非常相似。但圖2中標(biāo)記的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處存在細(xì)微差異，經(jīng)分析，紅外圖譜中Ⅰ處的差異可能是因為Tr-BC的—OH的締合程度相對較高，使吸收峰發(fā)生偏移所致[11]；Ⅱ處吸收強度不同可能主要是因為樣品中羰基和氨基含量不同所致；Ⅲ處的差異可能是由于三種樣品聚合度存在一定差異，C—O—C振動吸收峰發(fā)生偏移所致。

2.3.2 聚合度 三種培養(yǎng)方式所得細(xì)菌纖維素樣品的聚合度如表2所示，三者聚合度順序為：Tr-BC＞St-BC＞Ag-BC，由此可見，不同的培養(yǎng)方式對細(xì)菌纖維素的聚合度有較大的影響。其中，St-BC的聚合度與王敏[12]報道的結(jié)果相近，但低于Kunihiko Watanabe等[13]報道的結(jié)果，這可能是因為菌種或培養(yǎng)基不同導(dǎo)致的，具體原因還有待深入研究。

表2 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素聚合度分析結(jié)果Table 2 Polymerization degree analysis results of bacterial cellulose in different cultivationmethods

2.3.3 XRD分析 三種培養(yǎng)方式下合成的細(xì)菌纖維素的X-射線衍射圖譜如圖3所示。與靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素（St-BC）和搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Ag-BC）相似，淋澆發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Tr-BC）分別在14.1°、16.9°和22.9°附近存在三個衍射峰，此三個峰分別對應(yīng)纖維素晶體的＜101＞、＜101＞和＜002＞晶面，據(jù)此可知Tr-BC亦為I型纖維素[9，14]。

圖3 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素X-射線衍射圖（Cu-Ka）Fig.3 X-ray diffraction figure of bacterial cellulose in different cultivationmethods（Cu-Ka）

各樣品的結(jié)晶度與晶體粒徑的結(jié)果如表3所示，以I型纖維素的特征衍射峰（22.9°）和實際最強衍射峰（16.9°）計算的結(jié)晶度不同，但兩種計算方法下的結(jié)晶度均表現(xiàn)為Ag-BC＜Tr-BC＜St-BC，細(xì)菌纖維素晶體粒徑大小順序也為Ag-BC＜Tr-BC＜St-BC，這是由于剪切力的存在影響了纖維素的晶型情況，使纖維素的超分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，其原因是纖維素分子間的氫鍵在不同培養(yǎng)方式中發(fā)生了變化[15]。據(jù)顏志勇等[16]報道，結(jié)晶度與纖維的抗張強度、楊氏模量、硬度、伸長率、吸濕性、潤脹度、柔軟性等性質(zhì)有一定的關(guān)系，晶體粒徑與透明度、撕裂因子和裂斷長有關(guān)，這可為細(xì)菌纖維素的應(yīng)用提供依據(jù)。

表3 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度與晶體粒徑（nm）大小分析Table 3 Crystallinity and crystal size（nm）analysis of bacterial cellulose in different cultivationmethods

2.4 純度分析

分析三種培養(yǎng)方式下的細(xì)菌纖維素樣品，結(jié)果如表4所示。三者的纖維純度均較高，介于96%～98%之間，這與其他文獻[13，15]報道相一致，證實了細(xì)菌纖維素的高純度的特性。相比之下，Tr-BC的纖維純度高于St-BC和Ag-BC，這可能是因為靜態(tài)發(fā)酵時菌種生長于氣液界面，細(xì)菌纖維素層狀疊加成膜，由于膜面積較大，中間包裹的大量菌體和培養(yǎng)基難以處理徹底，故純度相對較低，此結(jié)論與紅外分析中波峰4、5反映的結(jié)果一致。

表4 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素的純度Table 4 Purity of bacterial cellulose in different cultivationmethods

2.5 持水性分析

細(xì)菌纖維素的持水性能以含水率和復(fù)水率表征[17]。三種培養(yǎng)方式下BC含水率和復(fù)水率如表5所示，Tr-BC的復(fù)水率在三種培養(yǎng)方式下最高，其含水率也高達98.18%，由此可知Tr-BC具有較好的持水性能。此外，三種樣品的復(fù)水率均低于含水率，St-BC更為明顯，這可能是因為烘干過程破壞了細(xì)菌纖維素原來的結(jié)構(gòu)，使其不能恢復(fù)到烘干前的溶脹狀態(tài)。

表5 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素的持水性Table 5 Water holding capacity of bacterial cellulose in different cultivationmethods

2.6 孔隙度分析

由表6可知，Tr-BC的孔隙度高于St-BC和Ag-BC。此外，本實驗結(jié)果比Weihua Tang等[18]報道的結(jié)果（92%）要低，這可能是由于采用不同干燥方式導(dǎo)致的結(jié)果。

表6 不同培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素的孔隙度Table 6 Porosity of bacterial cellulose in different cultivationmethods

2.7 熱重分析

圖4～圖6分別是淋澆發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Tr-BC）、靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素（St-BC）和搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素（Ag-BC）的TG-DSC圖譜（TG表示樣品在某個溫度下的失重率、DSC表示單位重量樣品在某個溫度下所造成的熱電偶的電位差）進行比較可知，三種培養(yǎng)方式下獲得的BC的TG曲線大致相同，根據(jù)三者的失重溫度范圍可以看出均包括失水、降解、煅燒三個階段，但每個階段的失重率各不相同，失水階段失重率大小順序為Tr-BC＜St-BC＜Ag-BC，這與前面所描述的三種細(xì)菌纖維素的含水率高低有關(guān)。降解階段中，質(zhì)量損失率大小順序為Tr-BC＞Ag-BC＞St-BC，這與降解階段持續(xù)時間長短有關(guān)。煅燒階段結(jié)束后，樣品殘渣剩余率大小順序為Tr-BC＞St-BC＞Ag-BC。

但三種培養(yǎng)方式下細(xì)菌纖維素的DSC曲線可以發(fā)現(xiàn)三者之間存在一定的差異。首先，降解階段的起始溫度和持續(xù)時間不同，起始降解溫度順序為Tr-BC＞St-BC＞Ag-BC，而持續(xù)時間順序為Tr-BC＞Ag-BC＞St-BC，這說明Tr-BC的熱穩(wěn)定性高于St-BC和Ag-BC。其次，St-BC和Ag-BC分別在373.6、366.1℃出現(xiàn)明顯的吸熱峰，而Tr-BC在346.0、501.6℃出現(xiàn)兩個放熱峰，這說明三者在降解過程中發(fā)生的物理化學(xué)反應(yīng)不同，進一步反映出三種細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)存在差異。

圖4 淋澆發(fā)酵細(xì)菌纖維素TG-DSC圖譜Fig.4 TG-DSCmap of tricking fermentation bacterial cellulose

圖5 靜態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素TG-DSC圖譜Fig.5 TG-DSCmap of static fermentation bacterial cellulose

圖6 搖瓶發(fā)酵細(xì)菌纖維素TG-DSC圖譜Fig.6 TG-DSCmap of shake fermentation bacterial cellulose

3 結(jié)論

不同培養(yǎng)方式對細(xì)菌纖維素的外觀形態(tài)、合成模式和微觀結(jié)構(gòu)有較大影響；Tr-BC在化學(xué)組成上與St-BC和Ag-BC無顯著差異，但其—OH的締合程度稍高；Tr-BC的聚合度高于St-BC和Ag-BC；Tr-BC的纖維純度高于St-BC和Ag-BC；由X-射線衍射分析結(jié)果可知，本實驗所得細(xì)菌纖維素為Ⅰ型纖維素，Tr-BC的結(jié)晶度和晶體粒徑小于St-BC大于Ag-BC；Tr-BC的含水率低于St-BC和Ag-BC，其復(fù)水率和孔隙度均高于St-BC和Ag-BC；熱重分析結(jié)果反映，Tr-BC的熱穩(wěn)定性略高于St-BC和Ag-BC，且三者在降解過程中發(fā)生的物理化學(xué)反應(yīng)不同，進一步反映出三種細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)存在差異。這些結(jié)果為細(xì)菌纖維素在食品及材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。

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Study on structure and properties of bacterial cellulose produced by trickling fermentation

ZHANG Li-ping1，2，LU Hong-mei1，2，*，PENG Xiang-ping1，2，DAIRui1，2
（1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guizhou University，Guiyang 550003，China；
2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550003，China）

Bacterial cellulose（BC）p roduced by trickling fermentation were stud ied，inc lud ing extrinsic shape，m ic rostructure，chem icalstructure，purity，water holding capacity，porosity and thermo g ravimetric characteristics. With the com parison to bacterial cellulose p roduced by static fermentation and shaking fermentation.The result showed that：for d ifferent BC cultivation methods，the extrinsic shapes，synthetic mode and m icrostructure were d ifferent.The-OH associating deg ree，the polymerization degree，purity，water holding capacity，porosity，

thermal stability of trickling fermentation BC was higher than those of static fermentation BC and shaking fermentation BC.But the c rystallinity and crystal grain size were less than that of static fermentation BC and greater than that of shaking fermentation BC and.

bac terial cellulose；trickling fermentation；structure；p roperty

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0197-05

2012－05－24 *通訊聯(lián)系人

張麗平（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國家自然科學(xué)基金（31160338）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合字[2010]2066）。