刁小琴，關(guān)海寧，馬松艷

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061)

中心組合設(shè)計優(yōu)化酶法輔助提取香菇多酚及其抑菌活性研究

刁小琴，關(guān)海寧，馬松艷

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061)

為研究溶劑法提取香菇多酚的工藝條件，在考察提取溫度、乙醇濃度、料液比及果膠酶添加量四個單因素對香菇多酚提取率影響的基礎(chǔ)上，采用中心組合實驗和二次多項式回歸分析對提取工藝進行優(yōu)化。實驗結(jié)果表明香菇多酚的最佳提取工藝為:水浴溫度85℃，提取劑乙醇濃度為50%，料液比1∶12(g∶mL)，果膠酶添加量1.4%，在此條件下，香菇多酚的提取率為2.94%。此外，對香菇多酚采用瓊脂平板擴散法進行抑菌實驗，結(jié)果表明:香菇多酚對青霉菌和啤酒酵母菌無抑制效果，而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，且最低抑菌濃度為15mg/mL。

香菇，多酚，提取，抑菌活性

多酚是在植物性食物中發(fā)現(xiàn)的具有潛在促進健康的一類次生代謝物［1］。大量研究表明，植物多酚在抗氧化、抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、減緩骨質(zhì)疏松、健齒、降血脂、血糖等方面具有良好的作用［2－4］。香菇在我國培育面積廣，是近年來我國發(fā)展最快的食用兼藥用菌類農(nóng)產(chǎn)品。目前對香菇活性物質(zhì)的研究主要集中在香菇多糖，并已應(yīng)用于醫(yī)藥中，而對于其具有抗氧化、抑菌等生理活性多酚的研究少有報道。本實驗以干香菇為材料，采用溶劑法提取香菇中的多酚并對提取工藝進行優(yōu)化，同時對香菇多酚進行抑菌活性研究，以期為開發(fā)天然抑菌劑提供理論基礎(chǔ)，并對拓展香菇深加工途徑及提升香菇產(chǎn)業(yè)價值有一定的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇 綏化市農(nóng)貿(mào)市場，自然晾干后粉碎過40目篩備用;果膠酶 酶活120萬u/g，和氏璧生物有限公司提供;焦性沒食子酸、福林酚試劑、無水乙醇、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯 分析純;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌和釀酒酵母菌 綏化學(xué)院微生物實驗室提供;細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;霉菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;MJX－100B－8型霉菌培養(yǎng)箱、HPX－9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［5］稱取25mg沒食子酸，加入到25mL去離子水中，得到1mg/mL的沒食子酸溶液。吸取5mL 1mg/mL的沒食子酸溶液，定容至50mL容量瓶中，即得0.1mg/mL的沒食子酸溶液，然后配成0、20、40、60、80、100μg/mL的沒食子酸標(biāo)液。取不同標(biāo)樣的沒食子酸溶液1mL，分別加入0.5mL福林試劑、2mL 10%碳酸鈉溶液，定容至10mL，室溫下反應(yīng)2h，用紫外可見分光光度計測定各溶液在760nm處吸光值。處理數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程 y=0.0115x+0.0055，相關(guān)系數(shù) R2= 0.9992，線性相關(guān)性良好。

1.2.2 多酚含量的測定 采用福林—酚比色法［5］，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算多酚含量及提取率。

1.2.3 香菇多酚提取工藝

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 水浴溫度的影響 固定料液比1∶20 (g∶mL)，提取時間2h，乙醇濃度60%，分別在50、60、70、80、90℃條件下進行浸提，考察溫度對香菇多酚提取效果的影響。

1.2.4.2 乙醇濃度的影響 固定料液比1∶20 (g∶mL)、提取溫度50℃、提取時間為2h，分別以濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液提取，考察乙醇濃度對香菇多酚提取效果的影響。

1.2.4.3 料液比的影響 提取溫度50℃、乙醇濃度60%，提取時間為2h，選擇料液比分別為1∶8、1∶12、1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)，考察料液比對香菇多酚提取效果的影響。

1.2.4.4 果膠酶添加量的影響 固定料液比1∶10 (g∶mL)、提取溫度 50℃，分別添加 1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的果膠酶，酶解10min后，80℃保溫10min，使酶滅活，濾渣用50%的乙醇以料液比1∶10(g∶mL)繼續(xù)浸提，考察果膠酶添加量對香菇多酚提取效果的影響。

1.2.5 中心組合設(shè)計實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定中心組合設(shè)計的自變量，以香菇多酚提取率為考察值，以二次多項式逐步回歸分析優(yōu)化提取條件，實驗因素與水平見表1。

表1 實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design test

1.2.6 香菇多酚的抑菌活性研究［6］

1.2.6.1 供試菌株的準(zhǔn)備 將供試菌種接入相對應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，每種菌接兩支重復(fù)，細菌置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h，霉菌培養(yǎng)44～48h，待用。

1.2.6.2 培養(yǎng)基的配制及平板的制備 配制的各種供試菌株的培養(yǎng)基，經(jīng)高壓蒸汽消毒滅菌，冷卻至50～60℃，無菌操作置于滅過菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約15～20mL，即培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基的厚度約2～2.5mm。

1.2.6.3 供試菌株懸浮液的制備 在超凈工作臺上進行無菌操作。用接種環(huán)挑取少許菌體于裝有10mL無菌水的試管中，用力振蕩，制成均勻的各種菌懸浮液，霉菌、酵母菌用血球計數(shù)板計數(shù)，細菌用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，調(diào)整菌懸液的濃度為105～106個/mL。

1.2.6.4 抑菌圈直徑的測定 采用濾紙片法，用無菌吸管吸取上述各種菌懸液0.5mL于平板上，然后用無菌涂布棒涂布均勻，待用。將多酚粗提取物配成質(zhì)量濃度為20mg/mL的水溶液，將直徑為9mm、已殺菌烘干的濾紙圓片浸入該多酚溶液中2h，撈出瀝干，貼于含菌平板中同時以水做空白實驗，每平板貼3片濾紙片，呈正三角形，重復(fù)3個平板，倒置培養(yǎng)，細菌于37℃培養(yǎng)20h，真菌28℃培養(yǎng)48h，細菌24h后觀察，真菌48h后觀察，用游標(biāo)卡尺測試培養(yǎng)基中抑菌圈的直徑。

1.2.6.5 最低抑菌濃度的確定 將香菇多酚配制成濃度分別為1、5、10、15、20mg/mL的溶液，研究樣品對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度，其實驗操作過程與1.2.6.4相同。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 實驗數(shù)據(jù)采用Excel2003軟件處理，DPS統(tǒng)計軟件對中心組合設(shè)計實驗結(jié)果進行二次多項式逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴溫度的影響

從圖1看出，溫度在50～90℃范圍內(nèi)，溫度越高，多酚提取效果越好。這可能是由于隨著溫度的升高，植物組織軟化變快，促進膨脹，從而增加可溶性物質(zhì)的溶解度和擴散速度，促進有效成分浸出，使蛋白質(zhì)凝固，酶被破壞，有利于物質(zhì)浸出。但是當(dāng)溫度不斷升高時，耗費的熱能大大增加，且溫度較高時，在密閉容器中將產(chǎn)生很高的內(nèi)壓，在非密閉容器中乙醇與水將會發(fā)生共沸而快速揮發(fā)，導(dǎo)致多酚的損失，因此溫度不是越高越好。此外，當(dāng)溫度不斷升高時，對熱不穩(wěn)定的成分就會分解或變質(zhì)，因此選取80℃為最佳提取溫度。

圖1 溫度對香菇多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on lentinus edodes polyphenols yield

2.2 乙醇濃度的影響

從圖2看出，當(dāng)乙醇濃度在40%～50%范圍內(nèi)，總酚的提取率較高?？赡苁欠宇愇镔|(zhì)含有酚羥基，具有一定的極性，提取過程中乙醇濃度會影響提取溶劑的極性，進而影響對多酚類物質(zhì)的溶解度及選擇性。隨著乙醇濃度的提高多酚提取率反而下降，可能是因為多酚類化合物很容易與蛋白、多糖形成復(fù)合物，不僅影響得率，而且會在以后的操作中造成沉淀損失，因此合適的乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對香菇多酚提取率的影響Fig.2 Effect of concentration of solvent on lentinus edodes polyphenols yield

2.3 料液比的影響

由圖3可知，料液比在1∶8～1∶12時，隨著液體含量的增加，從香菇中提取的多酚得率隨之增加，料液比在1∶12～1∶25時，提取率逐漸下降。這可能是因為酒精的揮發(fā)導(dǎo)致了多酚的溶出。另外，提取溶劑用量增大，對后面的過濾、濃縮以及提取溶劑的回收會造成較大的負面影響。因此，選取料液比1∶12為最佳。

圖3 料液比對香菇多酚提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on lentinus edodes polyphenols yield

2.4 果膠酶添加量的影響

從圖4看出，果膠酶添加量在1%～1.4%時，隨著酶添加量的逐步增加，多酚的提取率呈上升趨勢，這可能是因為果膠酶能夠降解細胞壁，提高了香菇中多酚類物質(zhì)的提取率，當(dāng)酶添加量超過1.4%，多酚提取率反而呈下降趨勢，一方面可能是果膠酶將多酚水解，進而影響多酚的提取率;另一方面由于酶分子已經(jīng)飽和，一部分酶分子沒機會與細胞壁結(jié)合，造成酶的浪費。

2.5 中心組合實驗結(jié)果與分析

利用中心組合實驗設(shè)計，確定3因素3水平，共15個實驗。其中12個析因點，3個零點。中心點重復(fù)實驗用來估計實驗誤差，以香菇多酚提取率為考察值做中心組合實驗，實驗結(jié)果如表2。

由DPS(Data Processing System)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件做二次多項式逐步回歸分析，同時擬合得出回歸方程:

圖4 果膠酶添加量對香菇多酚提取率的影響Fig.4 Effect of pectinase dosage on lentinus edodes polyphenols yield

表2 中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design test and results

進一步分析得出方程F=9.2167，相關(guān)系數(shù)R= 0.96164，顯著水平p=0.0072，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra =0.90797，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.14309。該方程自變量與應(yīng)變量之間相互影響的T檢驗和p值檢驗如表3所示。

表3 二次回歸方程各項參數(shù)的T值檢驗Table 3 T value test of the parameters

從表3看出，提取劑乙醇濃度的一次項和二次項的影響是極顯著的(p＜0.01)，提取溫度與乙醇濃度的交互項達到顯著水平(p＜0.05)，同時實驗所用模型是顯著的(p＜0.01)，說明回歸方程具有顯著意義，因此該方程能很好地擬合香菇多酚的提取過程。最終由回歸方程得出最高指標(biāo)時各個因素組合:Y= 3.01876，X1=85.000，X2=49.638%，X3=1.47910%，即提取溫度85.0℃、乙醇提取濃度49.638%、果膠酶添加量1.47910%，在此條件下香菇多酚的提取率為3.02%。

為檢驗預(yù)測結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行香菇多酚的提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為提取溫度85℃，乙醇濃度50%，果膠酶添加量1.4%，3次平行實驗得到的實際提取率為2.94%，與最優(yōu)理論值相近。

2.6 香菇多酚抑菌效果分析

2.6.1 抑菌圈直徑的確定 采用濾紙片法研究香菇多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌和釀酒酵母4種實驗菌的抑制效果，以抑菌圈直徑的大小為衡量指標(biāo)，實驗結(jié)果見表3。

表3 篩選菌株實驗Table 3 Experiment of filtrating fungus

結(jié)果表明:香菇多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果較為明顯，對啤酒酵母和青霉菌幾乎沒有抑菌效果;被抑制的細菌中既有革蘭氏陽性菌又有革蘭氏陰性菌，既有球菌又有桿菌。同時可以看出香菇多酚在抑制細菌方面，對大腸桿菌的抑制優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

2.6.2 香菇多酚最低抑菌濃度實驗 以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為供試菌，研究香菇多酚的最低抑菌濃度，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明:不同濃度的香菇多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制。香菇多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為15mg/mL，但相同濃度下對大腸桿菌的抑制效果比金黃色葡萄球菌好。

表4 香菇多酚最低抑菌濃度測定Table 4 Minimum antimicrobial concentrations of lentinus edodes polyphenols

3 結(jié)論

香菇多酚的最佳提取工藝條件為:料液比1∶12 (g∶mL)，提取溫度85℃，乙醇濃度50%，果膠酶添加量1.4%，在此條件下，香菇多酚得率為2.94%。通過抑菌實驗表明香菇多酚對啤酒酵母和青霉菌兩種真菌的生長沒有抑制效果，但對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌細菌均有明顯的抑制作用，且最低抑菌濃度均為15mg/mL，其中相同濃度下對大腸桿菌的抑菌效果更為明顯。

［1］宋立江，狄瑩，石碧.植物多酚研究與利用的意義及發(fā)展趨勢［J］.化學(xué)進展，2000，12(2):161－170.

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［4］尹志娜.植物多酚分離提取方法和生物功能研究進展［J］.生命科學(xué)儀器，2010(8):43－49.

［5］黃曉鈺，劉鄰渭.食品化學(xué)與分析綜合實驗［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008:206－208.

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Optimization of enzymic extraction by central composite design and study on antimicrobial activity of polyphenols in lentinus edodes

DIAO Xiao－qin，GUAN Hai－ning，MA Song－yan
(College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua College，Suihua 152061，China)

To explore the technology of extracting polyphenols from lentinus edodes，four single factors were studied including，extractive temperature，concentration of solvent，ratio of material to liquid，pectinase dosage.Based on the single factor tests，the optimum extraction technology was determined through center combination experiments and two degree polynomial regression analysis.The extractive temperature was 85℃，the ethanol concentration was 50%，the ratio of material to liquid was 1∶12，pectinase dosage was 1.4%.Under this condition，polyphenols extraction rate was 2.94%.After initinal purification of polyphenols，the bacteriostasis experiments were conducted using the agar plate dilution method.The results showed that the polyphenols from lentinus edodes had no antibacterial activity against fungi，but it had antibacterial activity against bacteria.In addition，the minimal inhibitory concentration for bothStaphylococcus aureusandEscherichia coliwere 15mg/mL.

lentinus edodes;polyphenols;extraction;antibacterial activity

TS202.3

B

1002－0306(2012)21－0269－04

2012－05－09

刁小琴(1979－)，女，講師，主要從事食品營養(yǎng)及農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏的研究教學(xué)工作。

綏化學(xué)院科研創(chuàng)新團隊基金資助項目(CX2008002)。