譙順彬，董汝晶，田 輝，張義明，3，羅 芳，陶希芹

(1.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽 550008;

2.貴州茅臺酒廠(集團(tuán))習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水 564622;

3.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽 550003)

生長因子對螺旋藻混合營養(yǎng)生長及藻膽蛋白含量影響的研究

譙順彬1，董汝晶1，田 輝2，張義明1，3，羅 芳1，陶希芹1

(1.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽 550008;

2.貴州茅臺酒廠(集團(tuán))習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水 564622;

3.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽 550003)

本文考察了維生素B12(VB12)、精氨酸(Arg)和萘乙酸(NAA)三個生長因子對螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)的影響，并對藻體干重(DW)及藻膽蛋白(PCP)的含量進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果表明:VB12對螺旋藻生長以及藻膽蛋白的積累均有較大影響，NAA對螺旋藻生長影響較大，而Arg對螺旋藻中藻膽蛋白含量影響較大;在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法(RSM)確定三個生長因子的最佳水平:VB12、Arg和NAA水平配比為0.08、45、0.3mg/L，此時藻體干重與藻膽蛋白含量分別增加了20.2%和31.9%;以VB12、Arg和NAA為自變量，建立了藻體干重和藻膽蛋白為響應(yīng)值的二次多項式數(shù)學(xué)模型。

螺旋藻，混合營養(yǎng)培養(yǎng)，生長因子，藻膽蛋白

螺旋藻(Spirulina)是一種具有光合作用能力的原核微生物，因其細(xì)胞呈絲狀、纏繞成螺旋狀而得名，又稱為藍(lán)細(xì)菌。螺旋藻屬于藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、段殖體目、顫藻科、螺旋藻屬［1］，目前發(fā)現(xiàn)有50多個種，其中以鈍頂螺旋藻(S.platensis)和極大螺旋藻(S.maixma)研究應(yīng)用最為普遍［2］。螺旋藻營養(yǎng)價值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、葉綠素、藻多糖、不飽和脂肪酸及微量元素等物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量約60%～70%，含有8種必需氨基酸且各氨基酸含量均衡，易于人體消化和吸收［3］。藻膽蛋白是存在于紅藻和藍(lán)藻中的光合色素，在螺旋藻中主要是藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白。其中，藻藍(lán)蛋白占細(xì)胞干重10%左右，這是螺旋藻細(xì)胞呈藍(lán)綠色或深綠色的原因，而藻紅蛋白的含量很少。螺旋藻藻藍(lán)蛋白安全無毒，著色力強(qiáng)，是一種理想的天然的食品著色劑。同時，螺旋藻中的藻多糖具有增強(qiáng)人體免疫力、防癌、防輻射損傷、抗突變、抑制癌細(xì)胞DNA的合成和抗衰老等作用［4－7］。因此，螺旋藻已逐步應(yīng)用于食品、醫(yī)療、保健等行業(yè)［8］。目前，螺旋藻規(guī)?；a(chǎn)都是采用室外大池培養(yǎng)，由于采用光合自養(yǎng)培養(yǎng)模式對地域和環(huán)境條件的依賴性強(qiáng)，培養(yǎng)產(chǎn)率低，這極大地制約了螺旋藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了滿足市場需求，提高產(chǎn)率，增加產(chǎn)量，各國研究人員一直在探索螺旋藻的培養(yǎng)方式。目前，螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)是解決這一發(fā)展瓶頸的主要研究方向?；旌蠣I養(yǎng)培養(yǎng)主要是通過添加合適的營養(yǎng)成分來降低藻體生長對環(huán)境的依賴，促進(jìn)藻體生長，實現(xiàn)高產(chǎn)［9］。如在螺旋藻培養(yǎng)過程中補(bǔ)加有機(jī)碳源葡萄糖已獲得了較好的研究結(jié)果。但是在螺旋藻培養(yǎng)過程中添加生長因子的研究報道還不多。因此，本研究在進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，考察生長因子對藻體細(xì)胞生長的影響，旨在為提高螺旋藻品質(zhì)以及產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鈍頂螺旋藻(S.platensis)fachb－350 中科院武漢水生生物研究所;采用傳統(tǒng)的Zarrouk培養(yǎng)基［10］作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，AB medium培養(yǎng)基作為對比實驗進(jìn)行培養(yǎng)，試劑均為分析純，蒸餾水配制后直接裝罐。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 在本實驗中，分別采用光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)條件進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)研究。在光合自養(yǎng)條件下，主要是對Zarrouk和AB medium兩種培養(yǎng)基進(jìn)行對比實驗，旨在篩選出適合鈍頂螺旋藻fachb－350生長的培養(yǎng)基。進(jìn)行對比實驗時，在250mL三角瓶中加入150mL新鮮培養(yǎng)基，接種量為10%，溫度30.0℃，初始pH9.5±0.1，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度4000lx左右，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 120r/min，培養(yǎng)時間 7d。Zarrouk培養(yǎng)基、AB medium分別記為A1、A2。采用混合營養(yǎng)培養(yǎng)時，根據(jù)Zarrouk和AB medium兩種培養(yǎng)基對比實驗的結(jié)果，選擇更適合藻體細(xì)胞生長的培養(yǎng)基進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)實驗。根據(jù)前期實驗結(jié)果，在所選的培養(yǎng)基中按1.5g/L的量添加葡萄糖時能獲得最大的藻體干重，因此，在本實驗過程中，保持光合自養(yǎng)培養(yǎng)條件不變的情況下，葡萄糖添加量為1.5g/L，培養(yǎng)時間延長至10d進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)研究。

1.2.2 單因素實驗 在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，根據(jù)螺旋藻的生長特性，實驗選取VB12、Arg、NAA三種生長因子進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)實驗，考察對藻體細(xì)胞生長及藻藍(lán)蛋白含量的影響，實驗先進(jìn)行單因素實驗，即在未添加另外兩種生長因子的條件下，研究另外一種因子對藻體細(xì)胞生長及藻藍(lán)蛋白含量的影響。

1.2.2.1 VB12對鈍頂螺旋藻生長的影響 本實驗主要是在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下研究VB12對藻體細(xì)胞生長的影響，VB12的添加濃度為 0.01、0.05、0.1、0.15、0.2mg/L，同時進(jìn)行對照實驗。

1.2.2.2 Arg對鈍頂螺旋藻生長的影響 本實驗主要是在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下研究Arg對藻體細(xì)胞生長的影響，Arg的添加濃度為10、25、50、75mg/L，同時進(jìn)行對照實驗。

1.2.2.3 NAA對鈍頂螺旋藻生長的影響 本實驗主要是在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下研究NAA對藻體細(xì)胞生長的影響，NAA的添加濃度為0.1、0.2、0.4、0.6mg/L，同時進(jìn)行對照實驗。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗 在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，以藻體干重及藻膽蛋白含量為實驗指標(biāo)，考察VB12、Arg和NAA對藻體細(xì)胞生長及藻膽蛋白合成的綜合影響。采用響應(yīng)面法中的中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計對VB12、NAA和Arg的最佳水平及其變化范圍進(jìn)行研究，實驗由Design Expert軟件設(shè)計，選取5個中心點(diǎn)重復(fù)，共17組，各因子實驗水平編碼分別－1、0、1，見表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表Table 1 Response surface analysis of factors and level table

1.2.4 藻體生物量測定方法采用干重法［9］(DW)培養(yǎng)結(jié)束后，用吸量管取發(fā)酵液20mL，放于已烘干至恒重的濾紙進(jìn)行抽濾，蒸餾水沖洗兩次，85℃烘干至恒重，用精密電子天平稱量。

1.2.5 藻膽蛋白測定方法 采用紫外分光光度法［11］。

1.2.6 光照強(qiáng)度的測定 用照度計LUX－101直接測定，單位:klx。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種培養(yǎng)基的結(jié)果比較

按照搖瓶培養(yǎng)方法，采用Zarrouk、AB培養(yǎng)基進(jìn)行光合自養(yǎng)，結(jié)果如表2所示。A1、A2培養(yǎng)基的藻體干重分別為0.5550、0.7128g/L，A2比A1增加約28%，表明經(jīng)改良的A2培養(yǎng)基比A1培養(yǎng)基對鈍頂螺旋藻的生長有利。培養(yǎng)結(jié)束后對培養(yǎng)液的pH進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)A2培養(yǎng)液中的pH略低于A1，主要原因是A2培養(yǎng)基中的碳源為NaHCO3和Na2CO3，這兩種成分能形成較好的緩沖溶液體系。因此，采用A2培養(yǎng)基培養(yǎng)螺旋藻能減少由于pH的過快上升引起對螺旋藻生長的影響。所以在接下來的研究過程中采用A2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)一步研究螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)的方法。

表2 不同培養(yǎng)基光合自養(yǎng)培養(yǎng)下的鈍頂螺旋藻生長情況Table 2 Different medium photosynthetic cultured of Spirulina growth

2.2 VB12對鈍頂螺旋藻生長的影響

在混合營養(yǎng)條件下，VB12對藻體細(xì)胞的生長及藻膽蛋白的含量影響見圖1。由圖可知，與對照實驗相比，添加VB12可以提高藻體干重以及增加藻膽蛋白的含量。當(dāng)VB12添加濃度為0.01～0.1mg/L時，藻體干重及藻膽蛋白含量均呈上升趨勢，當(dāng) VB12濃度為0.1mg/L時，藻體干重達(dá)到最大值1.5171g/L，而VB12添加濃度為0.01～0.1mg/L時，藻膽蛋白含量有明顯增加。根據(jù)四吡咯生物合成途徑分析［1］，可能的原因是VB12作為螺旋藻中藻膽色素以及葉綠素等生成的前體物質(zhì)之一，可以促進(jìn)螺旋藻生長過程中光能的轉(zhuǎn)化，達(dá)到為螺旋藻生長提供充足的能源。

2.3 Arg對鈍頂螺旋藻生長的影響

圖2表示添加不同濃度的Arg對藻體生長及藻膽蛋白含量的影響。在混合營養(yǎng)條件下，與對照實驗相比，添加一定濃度的Arg可以提高藻體干重以及增加藻膽蛋白的含量，但從增加趨勢來看，添加Arg對藻膽蛋白含量的影響更大，這很可能是在藻體細(xì)胞的生長過程中，Arg作為一種激素或激素前體的形式進(jìn)入細(xì)胞，通過提高細(xì)胞中的色素質(zhì)量比及酶的水平而促進(jìn)細(xì)胞的生長，從而能積累更多藻膽蛋白。同時，Arg還可以作為螺旋藻生長的備用氮源，保護(hù)合成的藻膽蛋白不會因氮源的缺少而被降解利用。

圖1 不同濃度的VB12對螺旋藻生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of VB12 on the growth of Spirulina

圖2 不同濃度Arg對螺旋藻生長的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Arg on the growth of Spirulina

2.4 NAA對鈍頂螺旋藻生長的影響

圖3表示添加不同濃度的NAA對藻體細(xì)胞生長及藻膽蛋白含量影響。在混合營養(yǎng)條件下，與對照實驗相比，添加一定濃度的NAA可以提高藻體干重，而藻膽蛋白的含量變化基本不明顯。當(dāng)NAA添加濃度為0.1～0.4mg/L時，藻體干重及藻膽蛋白含量均呈上升趨勢，當(dāng)NAA濃度為0.4mg/L時，藻體干重達(dá)到最大。其原因是NAA作為一種植物生長促進(jìn)劑，作用于細(xì)胞時能與細(xì)胞受體結(jié)合，從而促進(jìn)質(zhì)子分泌到細(xì)胞壁，致使細(xì)胞延伸快，還能促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的生物合成，為原生質(zhì)和光合膜的合成提供原料。然而，當(dāng)NAA濃度超過0.4mg/L時，藻體干重隨著NAA增加而降低。同時，從圖可知，在整個實驗過程中，添加NAA對藻膽蛋白含量的影響都不明顯。

圖3 不同濃度NAA對螺旋藻生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of NAA on the growth of Spirulina

2.5 生長因子對藻體干重及藻膽蛋白含量的影響

生長因子VB12、NAA和Arg對鈍頂螺旋藻生長的實驗結(jié)果見表3。

利用Design Expert 7.0對表3藻體干重DW數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得以DW為響應(yīng)值，VB12、Arg和NAA為自變量的二次多項式回歸方程:

DW=1.66－0.067A－0.04B－0.011C+8.250E－003AB－8.500E－003AC－1.750E－003BC－0.066A2－0.042B2－7.909E－003C2式(1)

對式(1)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。其中，F(xiàn)= 26.49＞F0.01(9，10)=4.94，p＜0.0001，說明該模型的概率在α=0.01水平上差異顯著;模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9640，說明藻膽蛋白的實驗值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度;其校正決定系數(shù)=0.9178，表明有約8%的藻體干重總量變異不能由該模型進(jìn)行解釋。

對方程(1)求導(dǎo)，當(dāng)VB12、Arg和NAA三個因子分別達(dá)到最佳水平0.092、61、0.394mg/L時，藻體干重最大預(yù)測值為1.6192g/L。

表3 響應(yīng)面分析實驗方案與實驗結(jié)果Table 3 Response surface analysis experiment scheme and experimental results

由表4可知，三個因子對藻體生長的影響大小依次為NAA＞VB12＞Arg，前兩個因子極其顯著(p＜0.01)，而Arg影響不大。

其次，從三個因子的交互作用來看，只有VB12和NAA對藻體生長影響較顯著(p＜0.05)，見圖4。其余兩兩交互均不顯著。

同時，利用Design Expert 7.0對表3藻膽蛋白含量PCP數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得以PCP為響應(yīng)值，VB12、Arg和NAA為自變量的二次多項式回歸方程:

對式(2)模型系數(shù)和概率進(jìn)行方差分析，F(xiàn)=38.01＞F0.01(9，10)=4.94，p＜0.0001，說明該模型的概率在α=0.01水平上差異顯著;模型復(fù)相關(guān)系數(shù) R2=0.9716，說明藻膽蛋白的實驗值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度;其校正決定系數(shù)=0.9640，表明有約3.36%的藻膽蛋白總量變異不能由該模型進(jìn)行解釋。

表4 DW回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗Table 4 Regression coefficient and their significance of the DW model

圖4 VB12和NAA對螺旋藻DW交互影響的曲面圖Fig.4 Response surface plot of DW versus VB12and NAA

對方程(2)求導(dǎo)，當(dāng)VB12、Arg和NAA三個因子分別達(dá)到最佳水平0.0662、25.6、0.2165mg/L時，藻膽蛋白最大預(yù)測值為168.1mg/g。

由表5可知，三個因子對藻體生長的影響大小依次為NAA＞VB12＞Arg，其中只有NAA對藻膽蛋白含量的積累影響顯著(p＜0.05)，而VB12和Arg影響均不明顯。

表5 螺旋藻藻膽蛋白含量回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗Table 5 Regression coefficient and their significance of the PCP model

從三個因子的交互作用來看，只有VB12和Arg對藻體生長影響較顯著(p＜0.05)，見圖5。其余兩兩交互均不顯著。

圖5 VB12和Arg對PCP交互影響的曲面圖Fig.5 Response surface plot of PCP versus VB12and Arg

2.6 優(yōu)化實驗

本研究不僅僅是為了獲得最大的藻體干重，同時也要積累更多的藻膽蛋白，以期獲得較高品質(zhì)的螺旋藻產(chǎn)品。因此，根據(jù)上述響應(yīng)面研究結(jié)果，在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，對VB12、Arg和NAA的最佳水平作進(jìn)一步優(yōu)化。實驗共5組，水平配比與結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明，當(dāng)VB12、Arg和NAA水平為0.08、45、0.3mg/L時，與未添加生長因子時相比，藻體干重與藻膽蛋白含量分別增加了20.2%和31.9%。實驗結(jié)果表明，三個生長因子不僅能提高細(xì)胞的生長速率，而且能促進(jìn)細(xì)胞中積累更多的藻膽蛋白。

表6 優(yōu)化實驗Table 6 Model validation experiments

3 結(jié)論

在本實驗中，分別進(jìn)行了光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)培養(yǎng)實驗。首先在光合自養(yǎng)條件下，采用Zarrouk和AB兩種培養(yǎng)基進(jìn)行螺旋藻培養(yǎng)對比實驗時，結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)條件下，AB培養(yǎng)基比Zarrouk培養(yǎng)基更有利于螺旋藻生長，藻體干重提高了近28%，故選擇AB培養(yǎng)基進(jìn)行混合營養(yǎng)實驗。其次，在混合營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，選取了VB12、Arg和NAA進(jìn)行研究，考察這三個因子對細(xì)胞生長及藻膽蛋白合成的影響。結(jié)果表明，當(dāng)VB12、Arg和NAA添加濃度分別為0.08、45、0.3 mg/L時，與對照實驗相比，藻體干重與藻膽蛋白含量分別增加了20.2%和31.9%;表明這三種生長因子不僅能提高細(xì)胞的生長速率，而且能促進(jìn)細(xì)胞中積累更多的藻膽蛋白，但是具體的機(jī)理以及在大規(guī)模的培養(yǎng)時的效果有待進(jìn)一步驗證。

［1］胡鴻鈞.螺旋藻生物學(xué)及生物技術(shù)原理［M］.北京:科學(xué)出版社，2003，10:9－34;

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The influence of positive growth factor on mixotrophic growth ofS.platensisand the content of phycobiliproteins

QIAO Shun－bin1，DONG Ru－jing1，TIAN Hui2，ZHANG Yi－ming1，3，LUO Fang1，TAO Xi－qin1
(1.Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008，China;
2.Guizhou MouTai(Grounp)Xi Jiu Company Limited，Xishui 564622，China; 3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550003，China)

In this paper，three critical growth factors were selected to research the influence for the growth of Spirulina platensis，employing the response surface methodology to optimize the culture conditions of biomass concentration and phycobiliprotein accumulation.Three critical factors selected for investigation were VB12，Arg and NAA.Firstly，single－factor experiment was used to determine the range which the biomass concentration of Spirulina platensishad the obvious improvement.Secondly，the response surface methodology was used to optimize the three factors，and to build up a quadratic regression equation with dry weight and PCP as the response，VB12，Arg and NAA as independent，respectively.Finally，after optimization of the experiment showed that，the best level was VB12，Arg and NAA 0.08，45，0.3mg/L，dry weight and phycobiliprotein content，an increase of 20.2%and 31.9%，respectively.

Spirulina platensis;mixtrophic growth;positive growth factor;phycobiliproteins

Q939.97

B

1002－0306(2012)21－0254－05

2012－05－24

譙順彬(1981－)，男，碩士研究生，研究方向:光生物反應(yīng)器的研究設(shè)計。

國家自然科學(xué)基金項目(39860004);貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目(黔科合J字［2010］2068號)。