劉長(zhǎng)建，劉 秋，姜 波，孫天竹，閆建芳

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選鑒定

劉長(zhǎng)建，劉 秋，姜 波，孫天竹，閆建芳

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

利用厭氧培養(yǎng)法，從豬的盲腸、小腸、大腸和糞便中篩選得到24株乳酸菌，液相色譜法測(cè)定產(chǎn)苯乳酸，有7株乳酸菌的苯乳酸產(chǎn)量在80～110mg/L之間，有4株的產(chǎn)量超過(guò)119mg/L，其中分離自豬糞便的菌株r16的苯乳酸產(chǎn)量最高，達(dá)到233.0mg/L。經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，最終確定菌株r16和m15為植物乳桿菌，而菌株m343和m462為糞腸球菌。

豬，乳酸菌，苯乳酸，鑒定

抗生素的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致了耐藥病原菌的產(chǎn)生，這些病原菌和抗生素本身會(huì)通過(guò)肉蛋等食物在人體內(nèi)富集，因此抗生素的使用正在被逐步取消和嚴(yán)格控制。有機(jī)酸在幾年內(nèi)可作為抗生素的替代品，而苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，就是一種新型的有機(jī)酸類抑菌物質(zhì)，與細(xì)菌素相比，苯乳酸具有更廣的抑菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌和真核微生物如曲霉、青霉等均有抑制作用［1］。其抑菌機(jī)理與溶菌酶類似，作用位點(diǎn)是細(xì)胞壁，而Nisin等細(xì)菌素作用于細(xì)胞膜［2－3］;也有研究推測(cè)苯乳酸因與苯丙氨酸脫氫酶的底物相似而產(chǎn)生抑制，從而改變了蛋白質(zhì)的表達(dá)［4－5］。苯乳酸能改善宿主的生長(zhǎng)性能，是由于其抗菌活性減少了微生物與宿主的競(jìng)爭(zhēng)，從而減少了營(yíng)養(yǎng)的損耗;另外，也能降低亞臨床感染的發(fā)生率和免疫介質(zhì)的分泌，從而改善了蛋白質(zhì)和能量的消化吸收效率［6］。苯乳酸逐漸作為天然防腐劑被應(yīng)用于食品工業(yè)，也用于醫(yī)藥和化妝品工業(yè)［1，7］，以及替代抗生素應(yīng)用在養(yǎng)殖業(yè)［6］。苯乳酸可由多種微生物產(chǎn)生，如白地霉［8］、紅球菌［5］、丙酸霉［9］和乳酸菌［10－11］。2000年，Lavermicocca［11］分離到的植物乳桿菌21B能發(fā)酵產(chǎn)生苯乳酸，產(chǎn)量為56mg/L。Valerio等［12］發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳酸菌(涉及12個(gè)種29株)都能夠產(chǎn)生苯乳酸;但產(chǎn)量較低，苯乳酸的濃度在16.6～99mg/L之間。李興峰等［13］分離的112株乳酸菌中有70株的苯乳酸產(chǎn)量在16.6～91.4mg/L之間。本研究通過(guò)高效液相色譜法快速檢測(cè)發(fā)酵液中苯乳酸含量的方法，從豬消化系統(tǒng)分離出高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

消化系統(tǒng)內(nèi)容物 采自當(dāng)?shù)剞r(nóng)家300日齡豬的小腸、盲腸、大腸和肛門等部位;苯乳酸(CAS20312－36－1，純度98%，百靈威)等主要試劑 均為分析純產(chǎn)品;PCR反應(yīng)所用的相關(guān)試劑 均購(gòu)于大連寶生物公司;培養(yǎng)基 包括MRS培養(yǎng)基(Merck)、M17培養(yǎng)基(Oxoid)、PY培養(yǎng)基和PYG培養(yǎng)基。

LC－20AB液相色譜儀 日本島津;CF15RX高速冷凍離心機(jī) 日本日立;DNP－9052恒溫培養(yǎng)箱上海精宏等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的初步分離及純化 無(wú)菌操作分別從現(xiàn)宰殺的豬的小腸、盲腸、大腸、肛門取內(nèi)容物。取1.0g樣品加入9.0mL生理鹽水，按10倍梯度稀釋，取100μL分別涂布于含碳酸鈣的2種固體培養(yǎng)基，37℃靜置厭氧培養(yǎng)24～48h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落，轉(zhuǎn)接于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。篩選過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性、HPLC法檢測(cè)產(chǎn)乳酸的菌株進(jìn)行下一步研究［14］。

1.2.2 高效液相色譜法的苯乳酸檢測(cè) 利用反相柱高效液相色譜法［13，15］檢測(cè)分析發(fā)酵液中的苯乳酸。色譜柱:C18(4.6mm×250mm，5μm，UG120，Shiseido);流動(dòng)相:A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液;洗脫程序:0～20min為10%～90% A;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;室溫;流速:1mL/min;進(jìn)樣量:20μL。

苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:稱取0.0100g苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于0.1%磷酸緩沖液(pH2.5)，定容5mL。然后稀釋苯乳酸溶液濃度分別為:0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/mL。用0.2μm膜過(guò)濾各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液后用高效液相色譜法測(cè)定，以苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg/mL)對(duì)峰面積A作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到了苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，測(cè)出的峰面積(y)與苯乳酸的濃度(x)成正比關(guān)系，用此種方法測(cè)定菌液苯乳酸產(chǎn)量的變化是切實(shí)可行的。

圖1 苯乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenyllactic acid

1.2.3 HPLC法篩選產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌 將菌株以5%的接種量分別接種于含2.0g/L苯丙氨酸的MRS和M17液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)36h。發(fā)酵液離心后取上清，0.2μm的膜過(guò)濾。由高效液相色譜測(cè)定苯乳酸的含量，篩選出高產(chǎn)苯乳酸的菌株。

1.2.4 乳酸菌的生物學(xué)特征 觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征;葡萄糖和葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)(V－P實(shí)驗(yàn))、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸測(cè)定。

1.2.5 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定 參照文獻(xiàn)［16］中的微波法稍加修改，提取基因組DNA。以F27(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和 R1492(5'－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3')為引物，對(duì)其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物委托寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。將菌株的測(cè)序結(jié)果輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用在線Blast程序與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)合 eztaxon網(wǎng)(http://147.47.212.35:8080/ index.jsp)的比對(duì)結(jié)果。并利用MEGA5.0的基于距離的鄰接法(Neighbor－Joining)，采用Kimura－2參數(shù)(Kimura 2－parameter)模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選

從豬源消化系統(tǒng)中分離到產(chǎn)生溶鈣圈的疑似菌株146株，其中24株的接觸酶反應(yīng)為陰性，經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察皆為陽(yáng)性菌。

24株乳酸菌在添加了苯丙氨酸的培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)36h后，將樣品的發(fā)酵液濾液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品在保留時(shí)間13.896～13.987min時(shí)有明顯的峰，與標(biāo)準(zhǔn)樣品出峰時(shí)間(13.937min)一致，液相色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明24株乳酸菌均能轉(zhuǎn)化苯丙氨酸產(chǎn)生苯乳酸，其中有11個(gè)菌株能夠至少產(chǎn)80mg/mL苯乳酸。從中篩選4株高產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌m15、r16、m343、m462，其中乳酸菌m15和r16是從豬的糞便中分離的，而乳酸菌m343分離自盲腸，菌株m462來(lái)自小腸(表1)。乳酸菌r16苯乳酸的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它菌株，達(dá)到233.0mg/L;而乳酸菌m15、m343和 m462的苯乳酸產(chǎn)量分別為 131.4、119.4、123.0mg/L。

表1 高產(chǎn)苯乳酸乳酸菌的篩選和其鑒定的結(jié)果Table 1 Phenyllactic acid－producing lactic acid bacteria and 16S rDNA identification

2.2 菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理生化特性

篩選出的4株乳酸菌革蘭氏染色均為陽(yáng)性，無(wú)芽孢，菌落的邊緣和表面都是整齊的。m15和r16的細(xì)胞多數(shù)是短桿狀，菌落為乳白色，比另外m343和m462的菌落要稍微扁平一些;而m343和m462多數(shù)為球形，其菌落為灰白色。

生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。4株乳酸菌均不能水解淀粉，石蕊牛奶均產(chǎn)酸，不能使明膠液化，且V－P實(shí)驗(yàn)結(jié)果也均為陰性，精氨酸均產(chǎn)氨，均能水解七葉苷。

表2 生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological characteristics of stains

2.3 16S rDNA鑒定

用微波提取乳酸菌基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在100V電壓下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在紫外燈下可見(jiàn)到清晰的條帶，PCR產(chǎn)物的分子量約為1500bp(圖3)。

圖2 樣品發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig.2 Chromatograms of strains culture medium supernatant

將測(cè)出的菌株 m15、r16、m343、m462的 16S rDNA序列提交到GenBank上，獲得登錄號(hào)分別是JQ340028、JN859533、JQ340029、JQ340033(見(jiàn)表1)。與NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株m15和r16的16S rDNA序列與多株Lactobacillus plantarum的16S rDNA序列同源性最高。經(jīng)過(guò)MEGA軟件的遺傳距離分析，與L.plantarumJCM 1149的同源性都達(dá)到99.8%。用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，顯示與L.plantarumJCM 1149聚在同一個(gè)分支。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征，因此可將乳酸菌m15和r16鑒定為L(zhǎng).plantarum。

而m343、m462菌株的16S rDNA序列與多株Enterococcus faecalis的16S rDNA序列同源性最高，與eztaxon網(wǎng)上比對(duì)結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)MEGA軟件的遺傳距離分析，與E.faecalisJCM 5803的同源性都達(dá)到99.9%。從GenBank中調(diào)取的親緣關(guān)系相近的16S rDNA全序列進(jìn)行聚類分析(圖4)，菌株 m343和 m462與E.faecalisJCM 5803在同一分支上。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征，可以確定菌株m343和m462都屬于腸球菌屬(Enterococcus)中的糞腸球菌(E.faecalis)。圖4中分枝上的數(shù)值為自舉(No.of Bootstrap Replicaion)1000次的結(jié)果。

圖3 乳酸菌的16S rDNA純化后的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern of purified 16S rDNA of strains

圖4 菌株m15、r16、m343、m462和參比菌株的16S rDNA基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain m15，r16，m343，m462 and the reference strains

3 結(jié)論

乳酸菌在自然界中分布廣泛，可棲居于人和動(dòng)物的消化道及其它器官內(nèi)，這些特點(diǎn)有利于將來(lái)更好地開發(fā)利用乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)從豬的消化系統(tǒng)分離純化出接觸酶反應(yīng)為陰性、革蘭氏染色為陽(yáng)性、能產(chǎn)乳酸的24株乳酸菌。采取在培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸的方法，37℃靜置培養(yǎng)36h，利用HPLC法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的產(chǎn)量，篩選出4株高產(chǎn)苯乳酸的菌株，苯乳酸產(chǎn)量均大于119mg/L，其中糞便中篩選出的乳酸菌 r16產(chǎn)苯乳酸的量最高，達(dá)到233.0mg/L。

通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA序列建樹分析，初步鑒定分離自糞便的菌株r16和m15為植物乳桿菌，而菌株m343和m462為糞腸球菌，分別來(lái)自盲腸和小腸。已經(jīng)有多株植物乳桿菌產(chǎn)苯乳酸的報(bào)道［1，11－13，17］，但腸球菌屬產(chǎn)苯乳酸的報(bào)道不多，Valerio等［12］從 奶 酪 中 分 離 的 屎 腸 球 菌 ATCC882 (Enterococcus faecium)能產(chǎn)生15.0mg/L苯乳酸，而腸球菌屬其它種，包括糞腸球菌還沒(méi)有關(guān)于產(chǎn)苯乳酸的報(bào)道。本研究和其它研究表明［12，17］，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代謝產(chǎn)物，個(gè)體差異大，其產(chǎn)量取決于菌株個(gè)體。

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Isolation and identification of phenyllactic acid－producing LAB

LIU Chang－jian，LIU Qiu，JIANG Bo，SUN Tian－zhu，YAN Jian－fang
(College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

By the anaerobic culture，24 strains of lactic acid bacteria were obtained from pig’s caecum，small intestine，large intestine and feces，which could produce phenyllactic acid by HPLC.Seven strains produced 80～110mg/L phenyllactic acid(PLA)，and four strains could produce even more than 119mg/L PLA.Strain r16 from feces showed the highest PLA－producing ability(233.0mg/L).Based on 16S rDNA sequencing analysis，combining with its morphological，physiological，and biochemistry test，strain r16 and sain m15 were identified asLactobacillus plantarum，and stain m343 and strain m462 asEnterococcus faecalis.

pig;Lactic acid bacteria;phenyllactic acid;identification

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0192－04

2012－04－05

劉長(zhǎng)建(1975－)，男，碩士，工程師，研究方向:應(yīng)用微生物。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31070005);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(DC120101031，DC120101034)。