李會品，孫桂芳，趙謀明，趙海鋒

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

發(fā)酵工藝參數(shù)對嫩啤酒抗氧化力的影響

李會品，孫桂芳，趙謀明，趙海鋒*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

為提高啤酒的抗氧化力及改善其風(fēng)味穩(wěn)定性，系統(tǒng)研究了麥汁發(fā)酵過程中抗氧化力的變化及發(fā)酵工藝參數(shù)包括麥汁濃度、酵母接種量、酵母代數(shù)與發(fā)酵溫度對嫩啤酒抗氧化力的影響。結(jié)果表明:麥汁發(fā)酵過程中DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力和還原力分別提高了6.27%、3.46%和31.38%。麥汁濃度從6°P增加到12°P，嫩啤酒的DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力與還原力升高顯著，濃度超過12°P后，抗氧化指標增速減緩或略有下降。酵母接種量在800～3200萬個/mL之間的嫩啤酒抗氧化力隨酵母接種量的增加而升高。1、2、4和5代酵母發(fā)酵嫩啤酒的抗氧化力隨酵母代數(shù)的增加呈降低趨勢。9、12和15℃發(fā)酵嫩啤酒的抗氧化力隨發(fā)酵溫度的升高而降低。因此，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)是提高啤酒抗氧化力的有效措施。

嫩啤酒，抗氧化力，發(fā)酵工藝參數(shù)，酵母

風(fēng)味穩(wěn)定性不僅是啤酒的一項非常重要的質(zhì)量指標，也是啤酒貨架壽命的制約因素。新鮮啤酒以其獨特的香味，清純、爽口的口感倍受人們的喜愛，然而隨著貯存時間的延長，啤酒的風(fēng)味逐漸發(fā)生變化，異雜味隨之出現(xiàn)，降低了啤酒的可飲用性。因此，如何延緩風(fēng)味老化，提高啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性是釀造界亟待解決的重要課題，也是啤酒行業(yè)目前面臨的最重要挑戰(zhàn)之一。盡管影響啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的因素眾多，但近來研究日益表明，啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性其實是由其內(nèi)源性抗氧化力決定的，提高啤酒的內(nèi)源性抗氧化力是改善風(fēng)味穩(wěn)定性的關(guān)鍵。以前對啤酒內(nèi)源性抗氧化力的研究主要集中于探討酚類物質(zhì)、二氧化硫等抗氧化物質(zhì)與抗氧化力和風(fēng)味穩(wěn)定性之間的關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)通過選育抗老化菌株、添加外源性抗氧化劑及優(yōu)化發(fā)酵工藝可以提高啤酒的抗氧化力及風(fēng)味穩(wěn)定性［1－4］，而關(guān)于發(fā)酵工藝參數(shù)對啤酒抗氧化力影響的系統(tǒng)研究較少。啤酒釀造過程十分復(fù)雜，從原料到包裝每一個階段都會影響成品啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性［5］。而麥汁發(fā)酵是啤酒釀造的最主要工序之一，也是酵母還原麥汁中老化物質(zhì)和生成某些特定抗氧化物質(zhì)的重要階段，最終發(fā)酵液的抗氧化力對成品啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性影響較大［6］。因此，系統(tǒng)研究麥汁發(fā)酵過程中抗氧化力的變化情況，以及發(fā)酵工藝參數(shù)包括麥汁濃度、酵母接種量、酵母代數(shù)與發(fā)酵溫度對嫩啤酒抗氧化力的影響，對于通過調(diào)整發(fā)酵工藝參數(shù)抑制啤酒老化前驅(qū)物的產(chǎn)生，提高啤酒抗氧化力，改善啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥芽 江蘇農(nóng)墾麥芽有限公司;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)、2，2'－偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、Trolox、Fluorescein 分析純，美國Sigma公司;其它所用試劑 分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

UV－2100型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;全波長掃描多功能讀數(shù)儀 美國Thermo公司;3－18K型低溫離心機 德國Sigma公司;低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設(shè)備廠;EL204/EL3002型電子天平 上海梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥汁制備及發(fā)酵 麥芽粉碎(7目)，按照常規(guī)麥汁制備工藝獲得不同濃度(6、9、12、15和18°P)的定型麥汁，121℃滅菌15min。取200mL定型麥汁于500mL三角瓶，接種酵母(接種量分別為800、1600、2400和3200萬個/mL，酵母代數(shù)分別為1、2、4和5代)，在低溫培養(yǎng)箱中恒溫(9、12和15℃)發(fā)酵，每天搖瓶2次。發(fā)酵過程中定時取樣，發(fā)酵液在6000r/min、4℃條件下離心12min，取上清液進行各指標的測定。

1.2.2 DPPH自由基清除活性(DSA)的測定［7－8］取0.1mL經(jīng)稀釋一倍的發(fā)酵液，加入 2.9mL 6×10－5mol/L的DPPH溶液，室溫下反應(yīng)1h后，于517nm比色，計算清除率，然后根據(jù)標準曲線y=0.6924x+ 0.003(x表示DPPH自由基清除清除率)計算Trolox值，結(jié)果表示為mmol Trolox值/L(mmol TE/L)。

1.2.3 氧自由基吸收能力(ORAC)的測定［9］取40μL稀釋200倍的發(fā)酵液于酶標板中，加入20μL熒光素溶液(70nmol/L)，于37℃保溫15min，然后加入140μL AAPH溶液(12mmol/L)，反應(yīng)2h，每隔2min讀取吸光值一次，根據(jù)標準曲線y=0.0006x－0.0009(x表示吸光值)計算 Trolox值，結(jié)果表示為mmol Trolox值/L(mmol TE/L)。

1.2.4 還原力(RP)的測定［7，10］取1mL經(jīng)稀釋4倍的發(fā)酵液與2.5mL 0.2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液、2.5mL 10%三氯乙酸溶液和2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50℃反應(yīng)20min，然后取2.5mL反應(yīng)液與2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%三氯化鐵溶液混合，室溫下反應(yīng)20min后，于700nm波長下測其吸光度，根據(jù)標準曲線y=0.7923x+0.0543(x表示吸光值)計算RP，表示為mmol抗壞血酸值/L(mmol AAE/L)。

1.2.5 方差分析 采用SPSS16.0軟件分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥汁發(fā)酵過程中抗氧化力的變化

為了闡明發(fā)酵過程(采用1代酵母、接種量2400萬個/mL、發(fā)酵溫度12℃)中抗氧化力的變化規(guī)律，跟蹤測定了12°P麥汁發(fā)酵過程中發(fā)酵液的DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力及還原力，結(jié)果見圖1(A)～(C)。由圖1可知，三種抗氧化指標在發(fā)酵過程中均呈逐漸上升的趨勢，發(fā)酵終了時DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力和還原力比發(fā)酵初期分別提高了6.27%(p＜0.05)、3.46%(p＞0.05)和31.38%(p＜0.01)。說明隨著發(fā)酵時間的延長發(fā)酵液的抗氧化力逐漸增強，這是因為酵母菌在發(fā)酵糖類生成乙醇的同時，利用胞內(nèi)氧化還原酶系還原發(fā)酵液中的氧化物質(zhì)，降低了發(fā)酵液中老化物質(zhì)的含量，同時二氧化硫濃度的增加也部分提高了發(fā)酵液的抗氧化力［11－12］。研究結(jié)果與徐春［11］等人的研究基本一致:純生啤酒發(fā)酵液的DPPH自由基清除率在發(fā)酵第1d上升迅速，而后上升保持平穩(wěn)。

圖1 發(fā)酵過程中發(fā)酵液抗氧化力的變化Fig.1 Evolution of the antioxidant activity during wort fermentation

2.2 發(fā)酵工藝參數(shù)對嫩啤酒抗氧化力的影響

2.2.1 麥汁濃度對嫩啤酒抗氧化力的影響 麥汁是酵母繁殖發(fā)酵的營養(yǎng)基質(zhì)，麥汁組成及濃度關(guān)系到酵母代謝及代謝產(chǎn)物的形成，是影響發(fā)酵液抗氧化物質(zhì)含量的重要因素之一［13］。固定酵母代數(shù)(1代)、接種量(2400萬個/mL)和發(fā)酵溫度(12℃)，比較不同濃度(6、9、12、15和18°P)麥汁發(fā)酵所得嫩啤酒的DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力及還原力，結(jié)果見圖2(A)～(C)。

由圖2可知，隨著麥汁濃度的增加，三種抗氧化指標總體都呈上升趨勢。麥汁濃度從6°P增加到12°P，嫩啤酒的三種抗氧化力指標均顯著升高(p＜0.05)，但麥汁濃度超過12°P之后，氧自由基吸收能力開始下降，DPPH自由基清除活性與還原力增速減緩。這是由于麥汁濃度越高，其含有的抗氧化物質(zhì)如酚類物質(zhì)越多，同時使得酵母細胞的滲透壓升高，酵母對葡萄糖的代謝途徑發(fā)生改變，產(chǎn)生較多的羰基化合物，它們與亞硫酸鹽的加合產(chǎn)物通過細胞膜分泌到發(fā)酵液中，使發(fā)酵液中SO2含量增加，從而增強了發(fā)酵液的抗氧化力。但原麥汁濃度在12°P以上時，嫩啤酒的抗氧化力并沒有明顯成倍增加，說明嫩啤酒的抗氧化力不僅受原料的影響，還受酵母還原能力的影響。在常濃麥汁發(fā)酵中，酵母對底物的利用率高，自身代謝旺盛，還原能力強;但是在高濃釀造中，由于受到高滲透壓和高乙醇濃度的作用，酵母細胞的代謝還原能力降低，發(fā)酵液中抗氧化物質(zhì)如SO2含量上升減緩，致使不能達到應(yīng)有的抗氧化力水平［14］。

圖2 麥汁濃度對嫩啤酒抗氧化力的影響Fig.2 Effects of wort gravity on the antioxidant activity of green beer

2.2.2 酵母接種量對嫩啤酒抗氧化力的影響 酵母接種量對啤酒發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在縮短發(fā)酵時間，獲得較高的細胞峰值數(shù)，接種量還對啤酒成分和風(fēng)味也有影響［15－16］。固定酵母代數(shù)(1代)和發(fā)酵溫度(12℃)，考察酵母接種量(分別為800、1600、2400

和3200萬個/mL)對12°P麥汁發(fā)酵所得嫩啤酒的抗氧化力的影響，結(jié)果如表1所示。隨著酵母接種量的增加，嫩啤酒的抗氧化力明顯升高(p＜0.01)。嫩啤酒的還原力隨酵母接種量的增加緩慢增強;接種量在800～2400萬個/mL之間的嫩啤酒DPPH自由基清除活性和氧自由基吸收能力升高幅度較大，接種量超過2400萬個/mL后其升高減緩，可能由于酵母接種量較大時，酵母細胞對底物利用的競爭加強，使更多的亞硫酸鹽被酵母代謝合成自身所需的氨基酸，這降低了酵母的還原能力，使最終嫩啤酒的抗氧化力并沒有明顯的增高［14］。綜上所述，適當提高酵母接種量，有利于改善嫩啤酒的抗氧化力。

表1 酵母接種量對嫩啤酒抗氧化力的影響Table 1 Effect of yeast inoculation amount on the antioxidant activity of green beer

2.2.3 酵母代數(shù)對嫩啤酒抗氧化力的影響 酵母菌種的好壞以及性能的優(yōu)劣對啤酒質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。不同代數(shù)酵母所處的生長狀態(tài)不同，代謝活性和還原能力也不同，最終發(fā)酵啤酒的抗氧化活性也存在一定差別。固定接種量(2400萬個/mL)和發(fā)酵溫度(12℃)，針對1、2、4和5代啤酒酵母，對12oP麥汁主酵結(jié)束時所得嫩啤酒的抗氧化力進行分析，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，經(jīng)1代酵母發(fā)酵的嫩啤酒，其三種抗氧化指標都明顯高于其他3代(p＜0.05)，可能是由于1代酵母的代謝活性最旺盛，形成的還原性物質(zhì)如二氧化硫最多。而4、5代酵母，由于傳代次數(shù)較多，出現(xiàn)衰老退化、菌種突變等現(xiàn)象，酵母死亡率升高，活性下降，對老化物質(zhì)的還原能力降低，表現(xiàn)出較弱的抗氧化性能［17］。故啤酒酵母代數(shù)較低時，發(fā)酵得到的嫩啤酒抗氧化力較強。2.2.4 發(fā)酵溫度對嫩啤酒抗氧化力的影響 溫度是酵母參與生化反應(yīng)的重要外界因素，其掌握妥當與否，直接關(guān)系到啤酒中發(fā)酵物質(zhì)包括抗氧化物質(zhì)的組成與含量［13］。固定酵母代數(shù)(1代)、接種量(2400萬個/mL)，將12°P麥汁分別置于9、12和15℃進行發(fā)酵，測定發(fā)酵終了時嫩啤酒的三種抗氧化指標，結(jié)果見表3。方差分析顯示，發(fā)酵溫度對氧自由基吸收能力和還原力影響極顯著(p＜0.01)，對DPPH自由基清除活性有顯著的影響(p＜0.05)。嫩啤酒的DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力和還原力總體上隨著發(fā)酵溫度的升高而降低。這可能是由于發(fā)酵溫度影響了酵母的增殖和代謝速率，以及最終嫩啤酒的抗氧化活性。理論上講溫度越高，酵母的繁殖和代謝越旺盛，對老化物質(zhì)的還原能力越強，所得嫩啤酒的抗氧化力越高。但事實并非如此，這可能是由于15℃發(fā)酵周期較短，產(chǎn)生的還原性物質(zhì)相對較少，對老化前驅(qū)物的還原并不充分，而9℃發(fā)酵周期較長，產(chǎn)生相對較多的還原性物質(zhì)，使嫩啤酒的抗氧化力較高。所以低溫發(fā)酵更有利于嫩啤酒保持較高的抗氧化力。

表2 酵母代數(shù)對嫩啤酒抗氧化力的影響Table 2 Effects of different yeast generation on the antioxidant activity of green beer

表3 發(fā)酵溫度對嫩啤酒抗氧化力的影響Table 3 Effects of fermentation temperature on the antioxidant activity of green beer

3 結(jié)論

麥汁發(fā)酵過程和發(fā)酵工藝參數(shù)對嫩啤酒抗氧化力具有顯著的影響。主酵結(jié)束，DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力和還原力分別提高了6.27%、3.46%和31.38%。麥汁濃度從6°P增加到12°P，嫩啤酒的DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力與還原力升高顯著，但當濃度超過12°P后，抗氧化指標增速減緩或略有下降。此外，抗氧化力隨酵母接種量的增加而升高，酵母接種量在800～2400萬個/mL之間的嫩啤酒DPPH自由基清除活性和氧自由基吸收能力升高幅度較大，而接種量超過2400萬個/mL后，其升高減緩。1代酵母發(fā)酵嫩啤酒的DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力與還原力都明顯高于2、4和5代酵母發(fā)酵嫩啤酒，隨著酵母代數(shù)的增加嫩啤酒的抗氧化力呈降低趨勢。9、12和15℃發(fā)酵嫩啤酒的抗氧化力隨發(fā)酵溫度的升高而降低。可見，在啤酒生產(chǎn)過程中，根據(jù)酵母生長的規(guī)律優(yōu)化主要發(fā)酵工藝參數(shù)，對于釀造高抗氧化力和風(fēng)味穩(wěn)定性好的啤酒具有重要意義。

［1］Priscila B S，Helena M A B，Gabriela A M.Polyphenols and antioxidant properties in forced and naturally aged Brazilian beer［J］.Journal of Brewing and Distilling，2011，2(3):45－50.

［2］程殿林，顏廷蘭，王亞楠，等.二氧化硫?qū)ζ【骑L(fēng)味穩(wěn)定性的影響［J］.山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2009(3):9－12.

［3］趙換英，陳葉福，王曉瓊，等.抗老化啤酒酵母菌株的誘變選育［J］.釀酒科技，2009，12:30－34.

［4］路玉蘭.超氧化物歧化酶在啤酒生產(chǎn)過程中的研究及應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2011(4):163－167.

［5］周廣田，聶聰，崔云前，等.啤酒釀造技術(shù)［M］.濟南:山東大學(xué)出版社，2005:264，422.

［6］李崎，潘學(xué)啟，顧國賢.選育抗老化啤酒酵母提高啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的研究［J］.生物工程學(xué)報，2004，20(6):912－914.

［7］趙海鋒.啤酒抗氧化力與風(fēng)味穩(wěn)定性的研究——提高內(nèi)源性抗氧化力及抑制反－2－壬烯醛形成的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2008.

［8］Gaulejac N S－C de，Provost C，Vivas N.Comparative study of polyphenol scavenging activities assessed by different methods［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(2): 425－431.

［9］Ou B，Hampsch－Woodill M，Prior R.Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49:4619－4626.

［10］Zhao H，Chen W，Lu J，et al.Phenolic profiles and antioxidant activities of commercial beers［J］.Food Chemistry，2010，119:1150－1158.

［11］徐春.純生啤酒老化過程與抗氧化活性的研究［J］.中國釀造，2008(14):58－59.

［12］李紅，宋常欣，吳永陽，等.啤酒抗氧化指標與風(fēng)味保鮮期的相關(guān)性研究［J］.釀酒科技，2005(1):57－64.

［13］余曉紅，陳洪興，汪志君，等.啤酒酵母代謝副產(chǎn)物高級醇的影響因素研究進展［J］.釀酒科技，2006(10):78－81.

［14］周梅.啤酒中的SO2及SO2對啤酒抗氧化作用的研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［15］Edelen C L，Miller J L，Patino H.Effects of yeast pitch rates on fermentation performance and beer quality［J］.Technical quarterly－Master Brewers Association of the Americas，1996，33 (1):30－32.

［16］Guido L F，Boivin P，Benismail N，et al.An early development of the nonenal potential in the malting process［J］.European Food Research and Technology，2005，220(2): 200－206.

［17］王勇，程殿林，顏廷蘭，等.不同條件對啤酒酵母硫化物產(chǎn)量的影響［J］.山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2009，23(2):33－36.

Effects of fermentation process parameters on the antioxidant activity of green beer

LI Hui－pin，SUN Gui－fang，ZHAO Mou－ming，ZHAO Hai－feng*
(College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

The evolution of antioxidant activity during wort fermentation and the effects of fermentation process parameters including the wort gravity，yeast inoculation amount，yeast generation and fermentation temperature on the antioxidant activity of green beer were studied systemically in order to improve the antioxidant activity and flavor stability of beer.Results showed that wort fermentation resulted in significant increases of 6.27%，3.46%and 31.38%in DPPH radical scavenging activity，oxygen radical absorbance capacity and reducing power for green beer，respectively.The increase of wort gravity(from 6 to 12°P)led to significant increases in DPPH radical scavenging activity，oxygen radical absorbance capacity and reducing power of green beer，whereas slow growth or slight decrease in antioxidant indices was detected when the wort gravity exceeded 12°P.In the range of 8 to 32 million/mL，the higher yeast inoculation amount resulted in the higher antioxidant activity of green beer.From 1 up to 5 generation，the antioxidant activity of green beer declined as the yeast generation increased.Furthermore，the antioxidant activity of three green beers(fermented at 9，12 and 15℃，respectively)decreased with the rise of fermentation temperature.Thus，it might be one of effective measures to improve antioxidant activity of beer by optimizing the fermentation process parameters.

green beer;antioxidant activity;fermentation process parameters;yeast

TS262.5

A

1002－0306(2012)21－0156－04

2012－05－14 *通訊聯(lián)系人

李會品(1989－)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

國家自然科學(xué)基金項目(31000810);廣東省科技計劃工業(yè)攻關(guān)項目(2010A010500002、2011A020102001);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(2012ZM0069)。