盧 靜，許琳莉，王振寧，叢 雯，黃國任，卜秀娟，關 爽

(吉林大學軍需科技學院食品質量與安全系，吉林長春 130062)

1，3-DCP通過激活線粒體凋亡通路誘導HepG2細胞凋亡

盧 靜，許琳莉，王振寧，叢 雯，黃國任，卜秀娟，關 爽*

(吉林大學軍需科技學院食品質量與安全系，吉林長春 130062)

本研究以HepG2細胞為模型，考察1，3－二氯丙醇(1，3－DCP)對HepG2細胞凋亡的影響和機制，為1，3－DCP肝毒性機制研究提供實驗依據。結果發(fā)現，1，3－DCP在160～640μg/mL濃度范圍內，作用于HepG2細胞8h，就可以降低細胞活性，誘導細胞凋亡，使細胞線粒體膜電位下降，細胞內ROS的增高，［Ca2+］i增高，并呈劑量依賴性。從而說明，通過線粒體凋亡通路誘導肝細胞凋亡是1，3－DCP的肝毒性機制之一。

1，3－二氯丙醇，肝毒性，線粒體，細胞凋亡

氯丙醇類化合物是目前國際上廣為關注的食品污染物之一，1，3－DCP(1，3－二氯丙醇，1，3－dichloro－2－propanol)是除3－MCPD(3－氯－1，2－丙二醇，3－monochloropropane－1，2－diol)外，研究得最多和最常見的食品氯丙醇類污染物［1］。1，3－DCP是食品中的脂質與氯離子在加工、烹飪和貯藏過程中發(fā)生反應而形成的［2］，此外，用ECH陰陽離子交換樹脂處理水也會產生大量1，3－DCP［1，3］。根據JEFCA的統計，1，3－DCP的世界平均飲食暴露量為0.008～0.090μg/ kg－bw/day，其中肉及肉制品占54%～72%［2］。由于1，3－DCP在工業(yè)生產(環(huán)氧樹脂、人造橡膠、表面活性劑、染料、制藥、造紙等工業(yè))中被大量地使用，因此其在水體等環(huán)境中也有大量殘留［4］。國際癌癥研究機構(IARC)將1，3－DCP列為2B類人類可能致癌物。1，3－DCP可被細胞色素P450酶氧化，具有遺傳毒性、致癌性、致畸性、生殖毒性、肝毒性、腎毒性、內分泌毒性、血細胞毒性和皮膚黏膜毒性，其中肝毒性

是其最主要的毒作用［2，3，5－10］，其肝毒作用機制源于代謝酶抑制、脂質過氧化和谷胱甘肽耗竭等［3，6，9，11］。研究顯示:1，3－DCP通過激活NF－КB和MAPK信號轉導路徑而誘導小鼠黑色素瘤細胞細胞凋亡［12］，但1，3－DCP是否會誘導肝細胞凋亡而產生肝毒性作用未見報道。因此，本研究以HepG2細胞為模型，考察1，3－DCP對 HepG2細胞凋亡的影響和機制，為1，3－DCP肝毒性機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2人肝癌細胞 上海中科院細胞庫;MTT、CM－H2DCFDA 美國 Sigma公司;DAPI、Fluo－3、DiBAC4(3) 日本Dojindo公司。

全自動酶標儀(RT－6000) 深圳Rayto公司;激光共聚焦顯微鏡(FV1000) 日本Olympus公司;倒置熒光數碼顯微鏡(AE31) 深圳Motic公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞活性測定［13］細胞以1×104/孔接種于96孔板，加入1，3－DCP，使其終濃度分別為160、320、640μg/mL，對照組加入同體積培養(yǎng)基。共同培養(yǎng)6h后，加入5%MTT 10μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，于全自動酶標儀570nm處測OD值。

1.2.2 細胞凋亡檢測［14］細胞以1×105/孔接種于24孔板，加入1，3－DCP，使其終濃度分別為160、320、640μg/mL，對照組加入同體積培養(yǎng)基。共同培養(yǎng)8h后，棄去上清，PBS洗2次。加入4%多聚甲醛室溫固定10min，加入甲醇(冷)固定20min，5μM DAPI染色液于37℃染色15min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 線粒體膜電位測定［15］細胞以1×105/孔接種于24孔板，加入1，3－DCP，使其終濃度分別為160、320、640μg/mL，對照組加入同體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)8h，移去培養(yǎng)基。PBS洗2次，加入無血清培養(yǎng)液，熒光探針DiBAC4(3)，37℃標記30min，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞內ROS測定［16］細胞以1×105/孔接種于24孔板，加入1，3－DCP，使其終濃度分別為160、320、640μg/mL，對照組加入同體積培養(yǎng)基。共同培養(yǎng)8h后，加 CM－H2DCFDA 5μM在 37℃下培養(yǎng)20min后，加入含有1%胎牛血清的HBSS，繼續(xù)培養(yǎng)40min。PBS洗2次后加入無血清的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)10min，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞內鈣離子濃度測定［16］細胞以1×105/孔接種于24孔板，加入1，3－DCP，使其終濃度分別為160、320、640μg/mL，對照組加入同體積培養(yǎng)基。培養(yǎng)8h后，移去培養(yǎng)液。PBS洗2次FLUO－3/AM熒光染液3μM，37℃培養(yǎng)20min，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 統計分析 每個實驗均設3個重復，結果以均值 ±標準偏差(Mean±S.D.)表示，采用 Images Advanced 3.2 software(Motic)軟件分割－計算各組光密度值，采用SPSS 13.0軟件組間t檢驗對數據進行分析，p＜0.05，具有顯著性差異，p＜0.01，具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 1，3-DCP對HepG2細胞活性的影響

MTT比色法是一種檢測細胞活性和增殖的有效方法［17］，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，細胞活性越強，產生的甲瓚越多。由圖1可以看出，1，3－DCP抑制HepG2細胞的活性，并呈劑量依賴性，說明1，3－DCP以160～640μg/mL劑量作用8h就對HepG2細胞產生毒性作用，尤其劑量大于320μg/mL時毒性更為明顯。

2.2 1，3-DCP對HepG2細胞凋亡的影響

細胞凋亡是多細胞生物共有的程序性自動死亡現象，也是毒物導致細胞損傷的常見機制之一［18］。早期凋亡細胞呈現核濃縮，染色加深;晚期凋亡細胞表現為核碎裂成大小不等的圓形小體，即凋亡小體。由圖2可以看出，1，3－DCP以160～640μg/mL劑量作用于HepG2細胞8h，使HepG2細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學改變，可見1，3－DCP能誘導HepG2細胞凋亡。

2.3 1，3-DCP對 HepG2細胞線粒體膜電位(ΔΨm)的影響

凋亡過程受凋亡信號和基因的精確調控，凋亡

圖1 1，3－DCP對HepG2細胞活性的影響Fig.1 Effect of 1，3－DCP on cell variability of HepG2注:與對照組(0μg/mL)比較，

圖2 1，3－DCP濃度對HepG2細胞凋亡的影響(600×)Fig.2 Effect of 1，3－DCP concentration on apoptosis of HepG2(600×)

信號通過Caspase依賴性通路，包括線粒體通路、死亡受體通路、內質網通路和凋亡誘導因子等介導的Caspase非依賴性途徑誘導細胞凋亡［19］。線粒體在細胞凋亡的過程中的起著樞紐作用，線粒體跨膜電位的降低是細胞凋亡早期的不可逆事件，線粒體膜內外的電勢差降低可引起線粒體膜內外一系列的生化改變，如誘導細胞色素C釋放，活化caspase蛋白酶家族，呼吸鏈與氧化磷酸化失耦聯，三磷酸腺苷合成停止，線粒體膜通透性改變，凋亡誘導因子(AIF)的釋放等，引起細胞凋亡的級聯反應，最終導致細胞凋亡［20］。由圖3可以看出，隨著1，3－DCP劑量的增加，ΔΨm逐漸降低，可見線粒體通路參與了1，3－DCP誘導的細胞凋亡。

2.4 1，3-DCP對HepG2細胞內ROS的影響

ROS對細胞增殖和信號轉導具有重要意義，但如果體內ROS過高則會對細胞造成氧化損傷。受損的細胞線粒體產生ROS，機體95%以上的ROS都來自線粒體電子漏［21］，ROS增高與線粒體膜電位的擴散常同時出現。ROS增高可使線粒體通透性轉換孔(MPTP)開放，MPTP開放可以將細胞色素C釋放至細胞漿，細胞色素C可以激活凋亡蛋白caspase9，caspase9可以激活caspase3，最終引起細胞的凋亡。由圖4可以看出，隨著1，3－DCP劑量的增加，細胞內ROS含量明顯升高，與線粒體膜電位降低一致。

圖3 1，3－DCP對HepG2細胞線粒體膜電位的影響(40×) Fig.3 Effect of 1，3－DCP on ΔΨm of HepG2

圖4 1，3－DCP對HepG2細胞內ROS的影響(40×)Fig.4 Effect of 1，3－DCP on cellular ROS of HepG2(40×)

2.5 1，3-DCP對 HepG2細胞內鈣離子濃度［Ca2+］i的影響

Ca2+是細胞信號轉導的第三信使，［Ca2+］i增高與凋亡密切相關。線粒體具有一套完整的Ca2+轉運系統，在細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的維持中起重要作用。一旦線粒體Ca2+轉運發(fā)生障礙，就會導致細胞內鈣穩(wěn)態(tài)紊亂［22］。胞漿高濃度的Ca2+能使線粒體Ca2+攝取增加，ATP合成抑制，線粒體膜電位降低，并能導致線粒體呼吸(電子傳遞)加速，氧自由基生成增加，導致線粒體內膜脂質過氧化損傷，累及Ca2+－ATP酶及Na+－K+－ATP酶，加重［Ca2+］i濃度，形成惡性循環(huán)。由圖5可以看出，隨著1，3－DCP劑量的增加，細胞內［Ca2+］i含量明顯升高，這與前面的實驗結果相一致。

3 結論

圖5 1，3－DCP對HepG2細胞內鈣離子濃度的影響(40×) Fig.5 Effect of 1，3－DCP on［Ca2+］i of HepG2(40×)

本文考察了1，3－DCP對HepG2細胞的細胞活性、細胞凋亡、線粒體膜電位、細胞內ROS含量和［Ca2+］i含量的影響。結果發(fā)現，1，3－DCP在160～ 640μg/mL濃度范圍內，作用于HepG2細胞8h，就可以降低細胞產生甲瓚的能力，說明1，3－DCP能降低HepG2細胞活性，具有肝毒性作用;細胞凋亡形態(tài)學檢測結果顯示HepG2細胞發(fā)生了凋亡的形態(tài)學改變，且呈劑量依賴性，可見1，3－DCP的肝毒性作用與其誘導 HepG2細胞凋亡密切相關;同時也發(fā)現1，3－DCP劑量依賴地降低線粒體膜電位、增加細胞內ROS和［Ca2+］i含量，說明1，3－DCP影響了線粒體的功能，線粒體功能失常是HepG2細胞凋亡的原因之一。由此可以得出:1，3－DCP能誘導HepG2細胞凋亡，線粒體凋亡通路參與該凋亡過程。

［1］Baer I，de la Calle B，Taylor P.3－MCPD in food other than soy sauce or hydrolysed vegetable protein(HVP)［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，396(1):443－456.

［2］Williams G，Leblanc JC，Setzer RW.Application of the margin of exposure(MoE)approach to substances in food that are genotoxic and carcinogenic Example:(CAS No.96－23－1) 1，3－Dichloro－2－propanol(DCP)［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48(1):S57－S62.

［3］Lee JC，Shin IS，Ahn TH，et al.Developmental toxic potential of 1，3－dichloro－2－propanol in Sprague－Dawley rats［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2009，53(1):63－69.

［4］Carro AM，Gonzalez P，Fajar N，et al.Solid－phase microextraction procedure for the determination of 1，3－dichloro－2－propanolin water by on－fibre derivatisation with bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2009，394(3):893－901.

［5］Kim HY，Lee SB，Lim KT，et al.Subchronic Inhalation Toxicity Study of 1，3－Dichloro 2－propanol in Rats［J］.Annals of Occupational Hygiene，2007，51(7):633－643.

［6］Eder E，Espinosa－Gonzalez J，Mayer A，et al.Autoxidative Activation of the Nematocide 1，3－Dichloropropene to Highly Genotoxic and Mutagenic Derivatives:Consideration of Genotoxic/ Carcinogenic Mechanisms［J］.Chem Res Toxicol，2006，19(7): 952－959.

［7］Kuroda Yoshiki，Fueta Yukiko，Kohshi Kiyotaka，et al.Toxicity of dichloropropanols［J］.Journal of UOEH，2002，24(3): 271－280.

［8］StottI，MurthyA，Robinson A，etal.Low－dose diethyldithiocarbamate attenuates the hepatotoxicity of 1，3－dichloro－2－propanol and selectively inhibits CYP2E1 activity in the rat［J］.Human＆Experimental Toxicology，1997，16 (5):262－266.

［9］Hammond AH，Fry JR.Effect of cyanamide on toxicity and glutathione depletion in rathepatocyte cultures:differences between two dichloropropanol isomers［J］.Chemico－Biological Interactions，1999，122(2):107－115.

［10］Omura M，Hirata M，Zhao M，et al.Comparative Testicular Toxicities of Two Isomers of Dichloropropanol，Dichloropropanol，2，3－Dichloro－l－propanol，and 1，3－Oichloro－2－propanol，and Their Metabolites Alpha－Chlorohydrin and Epichlorohydrin，and the Potent Testicular Toxicant 1，2－Dibromo－3－chloropropane［J］.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，1995，55(1):1－7.

［11］Katoh T，Haratake J，Nakano S，et al.Dose－dependent effects of dichloropropanol on liver histology and lipid peroxidation in rats［J］.Industrial Health，1998，36(4):318－323.

［12］Park SY，Kim YH，Kim YH，et al.1，3－Dichloro－2－propanol induces apoptosis via both calcium and ROS in mouse melanoma cells［J］.Biotechnol Lett，2010，32(1):45－51.

［13］Hansen M B，Nielsen S E，Berg K.Re－examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill［J］.J Immunol Methods，1989，119(2):203－210.

［14］Kim J，Park YJ，Jang Y，et al.AMPK activation inhibits apoptosis and tau hyperphosphorylation mediated by palmitate in SH－SY5Y cells［J］.Brain Research，2011，1418:42－51.

［15］Xie Y，Zhuang ZX.Chromium(VI)－induced production of reactive oxygen species，change of plasma membrane potential and dissipation ofmitochondria membrane potentialin Chinese Hamster Lung cell cultures［J］.Biomedical and Environmental Sciences，2001，14(3):199－206.

［16］Yamashiro K，Sasano T，Tojo K，et al.Role of transient receptor potential vanilloid 2 in LPSinduced cytokine production in macrophages［J］.Biochem Biophs Res Commun，2010，398 (2):284－289.

［17］趙嘉慧，張華屏，王春芳.MTT法再見測細胞增殖方面的探討［J］.山西醫(yī)科大學學報，2007，38(3):262－263.

［18］Valente MJ，Henrique R，Vilas－Boas V，et al.Cocaineinduced kidney toxicity:an in vitro study using primary cultured human proximaltubularepithelialcells［J］.Archivesof Toxicology，2012，86(2):249－261.

［19］Kumari Kavita K，Setty O H.Protective effect of Phyllanthus fraternus against mitochondrial dysfunction induced by coadministration of cisplatin and cyclophosphamide［J］.Journal of Bioenergetics and Biomembranes，2012，44(1):179－188.

［20］陳慧莉，李建華，王樹慶.線粒體跨膜電位和細胞凋亡相關性的研究［J］.醫(yī)學綜述，2007，13(14):1041－1043.

［21］Liu Shu－sen.Cooperation of a reactive oxygen cycle with the Q cycle and the proton cycle in the respiratory chain－superoxide generating and cycling mechanisms in mitochondria［J］.J Bioenerg Biomember，1999，31(4):367－376.

［22］孫磊.納米SiO2顆粒對HepG2細胞的毒性及相關機制研究［D］.長春:吉林大學，2011.

1，3－DCP induced HepG2 cells apoptosis through mitochondrial signaling pathways

LU Jing，XU Lin－li，WANG Zhen－ning，CONG Wen，HUANG Guo－ren，BU Xiu－juan，GUAN Shuang*
(Department of Food Quality and Safety，College of Light Industry Economics and Management，Changchun University，Changchun 130062，China)

In this paper，the cell variability，apoptosis，mitochondrial membrane potential(ΔΨm)and intracellular calcium content(［Ca2+］i)were evaluated to explain the hepatotoxic mechanisms of 1，3－DCP.The results indicated that 1，3－DCP decreased the cell variability，induced apoptosis，decreased ΔΨm and increased［Ca2+］i at the dose of 160～640μg/mL.Therefore，we could conclude that 1，3－DCP induced HepG2 cells apoptosis through mitochondrial signaling pathways.

1，3－dichloro－propanol;hepG2 human hepatoma cells;htpatotoxic effects;mechanism of action

TS201.2

A

1002－0306(2012)21－0081－04

2012－04－09 *通訊聯系人

盧靜(1976－)，女，博士，副教授，主要從事食品毒理學研究。

吉林大學基本科研業(yè)務費科學前沿與交叉學科創(chuàng)新項目(450060445292)。