張 汆，徐幸蓮，周光宏，李春保，李 玲

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095;

2.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000)

芡種殼乙醇提取物組成及其抗氧化穩(wěn)定性分析

張 汆1，2，徐幸蓮1，*，周光宏1，李春保1，李 玲1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095;

2.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000)

研究以乙醇為溶劑，從芡種殼中得到兩種提取物:A和B，采用HPLC－UV法對(duì)其中多酚組分進(jìn)行了分析，并對(duì)其在不同條件下的抗氧化穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，芡種殼提取物A和B中均含有豐富的多酚物質(zhì)(763.65、517.04mg/g)，主要多酚物質(zhì)是:沒(méi)食子酸(314.0、281.4mg/g)、兒茶素類、蘆丁(54.68、44.81mg/g)和少量綠原酸。抗氧化穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，芡種殼提取物對(duì)高壓滅菌、紫外線和強(qiáng)堿性環(huán)境均非常敏感，尤其是堿性條件下，其抗氧化活性(還原力和DPPH·清除活性)幾乎損失殆盡;在強(qiáng)酸性條件下，其還原力和DPPH·清除活性不僅不會(huì)降低，反而顯著增加。因此，芡種殼提取物可以添加到一些酸性食品中。

芡種殼提取物，抗氧化活性，穩(wěn)定性

芡實(shí)是睡蓮科(Nymphaeaceae)芡屬植物(Euryale Salisb.exDC.)芡(Euryale ferox)的種仁，俗稱“雞頭米”，是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥原料和滋補(bǔ)食材，除具有“補(bǔ)腎、健脾、養(yǎng)胃”等中醫(yī)理論功效外，還具有抗氧化［1－2］、修復(fù)心肌局部缺血［3］的功效。芡種子外有一層木質(zhì)種殼(厚度1～2mm)，約占其種子質(zhì)量的40%～50%，是芡米加工中的主要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量過(guò)萬(wàn)噸，目前尚未開發(fā)利用。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)芡實(shí)的研究較少，主要集中在營(yíng)養(yǎng)組分分析［4－5］、生理活性［6－8］以及加工［9］等方面，對(duì)其副產(chǎn)物利用方面的研究很少。鄧宇等［10］、王和才等［11］先后在芡果皮中檢測(cè)到豐富的鞣質(zhì)。孫文凱等［12］研究發(fā)現(xiàn)，芡種殼提取物顯示出很強(qiáng)的體外抗氧化活性。張汆等［13］研究顯示，芡種殼中含有豐富的多酚物質(zhì)，目前，有關(guān)芡種殼中多酚物質(zhì)的相關(guān)研究還未見有文獻(xiàn)報(bào)道。多酚物質(zhì)是一類植物次生代謝產(chǎn)物，在自然界各種植物組織中廣泛存在。植物多酚物質(zhì)一般具有多種生理活性，如抗菌、抗炎、抗氧化等，現(xiàn)已廣泛用于生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，典型代表如茶多酚［14］、葡萄和葡萄籽多酚［15］、蘋果多酚［16］、石榴皮多酚［17］等。不同來(lái)源的多酚物質(zhì)，生理活性差異很大。為進(jìn)一步利用芡種殼資源，該研究擬采用溶劑浸提法，從芡種殼中制備兩種多酚提取物，對(duì)其理化性質(zhì)和化學(xué)組分分析的基礎(chǔ)上，對(duì)其抗氧化穩(wěn)定性進(jìn)行分析，為其作為天然抗氧化劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡實(shí) 由安徽省天長(zhǎng)市勝達(dá)芡實(shí)專業(yè)經(jīng)濟(jì)合作社提供，新鮮芡果實(shí)于2010年10月采收后，取出種子，手工剪開種殼，收集芡種殼，并于40℃烘箱內(nèi)干燥后，粉碎(過(guò)100目篩網(wǎng))，裝入聚乙烯自封袋內(nèi)，于4℃冰箱內(nèi)貯藏，備用;DPPH·(1，1－二苯基－2－苦肼基自由基) 純度＞97.0%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;茶多酚(TP) 純度98%，無(wú)錫市世紀(jì)生物藥業(yè)有限公司;蘆丁、沒(méi)食子酸、綠原酸、兒茶素等標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;高效液相色譜用甲醇、乙酸等試劑 色譜純;其他常規(guī)試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司。

CP124S型分析天平 德國(guó) Sartorius公司; FW135型粉碎機(jī) 天津泰斯特;L550型大容量離心機(jī) 湖南湘儀;LGJ－10B型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán); RE－85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州科工貿(mào);DGX－9073BC－1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海?，?UV－2450PC型紫外－可見分光光度計(jì) 日本島津;KQ－300DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器 昆山市超聲波儀器有限公司;GKYS型無(wú)菌操作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰公司;精密微量移液器(100－5000μL) 德國(guó)Eppendorf;WH－2型微型旋渦混合儀 上海滬西;M2e型酶標(biāo)儀、Waters e2695 HPLC高效液相色譜儀、Waters 2489 UV－visible檢測(cè)器 美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芡種殼提取物制備 取芡種殼粉100g，加入500mL無(wú)水乙醇，于20℃下超聲浸提30min。抽濾，濾渣用無(wú)水乙醇浸提2次，合并濾液，減壓回收溶劑后，真空冷凍干燥48h，即得芡種殼提取物(A)。提取A后剩余的濾渣加入500mL 50%乙醇水溶液，采用上述方法浸提，得到芡種殼提取物(B)。兩種提取物分別裝入棕色瓶?jī)?nèi)，－20℃低溫貯藏，備用。

1.2.2 提取物中常規(guī)組分分析 總酚含量:采用Folin－Ciocalteus(FC)試劑法測(cè)定［18］;總糖含量:采用苯酚－硫酸法測(cè)定［19］;蛋白質(zhì)含量:采用凱氏定氮法測(cè)定。

1.2.3 提取物中多酚組分分析 將提取物A和B分別溶于甲醇和 50%甲醇水溶液中，濃度調(diào)整為1000μg/mL，濾液經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾后，用于 HPLC分析。

高效液相色譜(HPLC)條件:Waters e2695液相色譜儀，Waters 2489 UV－visible檢測(cè)器，Sunfire C18柱(5μm，4.6mm×250mm)。流動(dòng)相為甲醇∶1%乙酸(30∶70，v/v)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量5μL，柱溫35℃。

1.2.4 提取物抗氧化性分析 總還原力測(cè)定:采用鐵氰化鉀比色法，參照Chatchawan Chotimarkorn等［20］的方法測(cè)定。DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)清除活性分析:采用比色法，參照Seok Hyum Nam等［21］和Chang W.Choi等［22］的方法測(cè)定。

配制不同濃度的芡種殼提取物和茶多酚(TP)、維生素C(VC)。分別經(jīng)過(guò)高壓滅菌、紫外照射、酸和堿處理，比較處理前后各樣品還原力和清除DPPH自由基活性的變化，評(píng)價(jià)其抗氧化穩(wěn)定性。

抗氧化穩(wěn)定性:定義為樣品處理前后抗氧化活性的變化，以其抗氧化活性損失的百分率表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和DPSv7.55數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用多重比較法進(jìn)行顯著性分析(顯著性水平p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡種殼提取物組分分析

分析結(jié)果表明，芡種殼中含有豐富的總酚(183.17mg/g，干基)，芡種殼提取物A和B中的總酚含量分別為:763.65、517.04mg/g(干基)，不含蛋白質(zhì)類物質(zhì)(表1)，其紫外吸收光譜與茶多酚(TP)很相似，均在212nm和278nm處有強(qiáng)吸收，說(shuō)明提取物A和B中主要組分應(yīng)為多酚類物質(zhì)。此外，兩種提取物中總糖含量接近，但是采用HPLC法又檢測(cè)不到任何游離單糖，故推測(cè)A、B所含組分分子中可能含有遇酸可水解的糖苷鍵，如單寧和蘆丁。

采用乙醇和50%乙醇水溶液依次提取，提取物總得率達(dá)20%以上，其中總酚含量也較高，因此，在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面具有一定的開發(fā)價(jià)值。

目前，國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)芡實(shí)中多酚物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道，這為本實(shí)驗(yàn)中多酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇帶來(lái)一定困難，只能準(zhǔn)備一些植物中最常見的多酚物質(zhì)作為本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。根據(jù)HPLC－UV法分析結(jié)果，結(jié)合各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其紫外吸收光譜特性，初步分析表明，芡種殼提取物中主要多酚物質(zhì)為沒(méi)食子酸、蘆丁和少量綠原酸，TP中主要含有沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸和表兒茶素。此外，在保留時(shí)間2.85min附近還有1～2個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，因缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，尚不能定性是何種物質(zhì)(表2和圖1)，尚需做深入分析。在提取物A和B中均檢測(cè)出較豐富的蘆丁組分，其分子結(jié)構(gòu)中就含有糖基，該結(jié)果與前述推測(cè)是一致的(表1)。

2.2 抗氧化穩(wěn)定性分析

高壓、高溫、紫外、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性條件在食品加工中經(jīng)常會(huì)涉及到，因此，為了解兩種芡種殼提取物在上述條件下的穩(wěn)定性，本研究以提取物的體外抗氧化活性為主要指標(biāo)，對(duì)其在上述條件下的變化進(jìn)行分析。

2.2.1 高溫高壓滅菌條件 模擬高壓滅菌(High pressure sterilization，HPS)條件，將不同濃度的提取物溶液在121℃高壓滅菌器內(nèi)處理20min后取出，測(cè)定其滅菌前后抗氧化活性(總還原力和DPPH·清除活性)變化，同時(shí)與同濃度的茶多酚(TP)和維生素C (VC)比較。結(jié)果顯示，經(jīng)滅菌處理，兩種提取物和TP、VC溶液的還原力均顯著降低，損失率均超過(guò)50%，最高損失率達(dá)81.42%(A，1.0mg/mL)。不同提取物溶液濃度對(duì)其總還原力損失的影響不同，在較低濃度時(shí)，提取物A和B溶液的總還原力損失率較小，而TP和AA的損失率反而更高(表3)。兩種芡種殼提取物的DPPH·清除活性在滅菌處理前后變化不顯著(p＜0.05)，這可能與兩種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的原理有關(guān)［23］。上述結(jié)果也表明，僅憑一個(gè)抗氧化方法難以對(duì)提取物的抗氧化穩(wěn)定性作出全面評(píng)價(jià)。

表1 芡種殼提取物理化性質(zhì)分析Table 1 The compositions analysis of extracts

表2 芡種殼提取物和茶多酚中主要多酚組分含量Table 2 The major polyphenols compositions of EFS extracts and tea polyphenols

表3 高壓滅菌處理對(duì)芡種殼提取物總還原力的影響Table 3 Total reducing power and DPPH·scavenging activities of EFS extracts treated with HPS

圖1 芡種殼提取物和茶多酚的HPLC－UV圖Fig.1 The HPLC potography of EFS extracts and tea polyphenols

2.2.2 紫外處理 將不同濃度的提取物溶液置于紫外燈下照射不同時(shí)間后取出，立即分析其總還原力和DPPH·清除活性。結(jié)果表明，所有提取物和TP、VC溶液對(duì)紫外線異常敏感，尤其是低濃度溶液，經(jīng)30min照射后，芡種殼提取物的總還原力損失大半，TP和VC溶液總還原力損失96%以上。處理60min后，所有低濃度溶液還原力完全消失，高濃度溶液的損失也在45%以上，相比之下，兩種芡種殼提取物損失較小(表4)。與滅菌處理相似的是，所有樣品溶液在紫外處理后的DPPH·清除活性變化幅度不大，但是在較低濃度(0.05mg/mL)時(shí)，隨紫外處理時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH·清除活性顯著降低(p＜0.05)，在較高濃度時(shí)，降低不顯著(表5)。

表4 紫外處理后提取物溶液還原力損失率(%)Table 4 Reducing power lose rate of extracts and AA solutions in ultraviolet(%)

2.2.3 酸處理 將不同濃度的樣品溶液用3.25mol/L的鹽酸溶液處理1～3h后，測(cè)定其總還原力和DPPH·清除活性。結(jié)果表明，酸處理1h后，所有低濃度樣品溶液的還原力均顯著增高，其中芡種殼提取物還原力增加了1倍多。隨樣品溶液濃度的增加，酸處理后還原力增加幅度降低(表6)。一般認(rèn)為，多酚類物質(zhì)在酸性條件下比較穩(wěn)定，但在較高的酸濃度下，一些多酚物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵(如糖苷鍵、酯鍵)可能會(huì)發(fā)生水解，產(chǎn)生了還原力更強(qiáng)的物質(zhì)，從而導(dǎo)致樣品溶液的還原力顯著增加，如芡種殼提取物中檢出的蘆丁、兒茶素類物質(zhì)。隨酸處理時(shí)間延長(zhǎng)，各樣品還原力增加不顯著(p＜0.05)。酸處理?xiàng)l件下，各樣品DPPH ·清除活性在處理1h后顯著增加(p＜0.05)并達(dá)到峰值，此后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，增加不明顯(表7)。

表5 紫外處理后樣品溶液DPPH·清除活性變化(%)Table 5 The scavenging DPPH·activities of extracts treated with ultraviolet(%)

表6 酸處理下提取物總還原力變化Table 6 The total reducing power changes of extracts treated with acid

表7 酸處理下提取物DPPH·清除活性變化(%)Table 7 The DPPH·scavenging ability of extracts treated with acid(%)

2.2.4 堿處理 各樣品溶液(5mL)中加入0.1mL 0.5mol/L的NaOH溶液，混合5min后分別測(cè)定其還原力和DPPH·清除活性。結(jié)果表明，所有樣品溶液在堿性環(huán)境下均極不穩(wěn)定，其還原力和DPPH·清除活性均損失大半，其中低濃度下?lián)p失更大(表8)。相同樣品的還原力和DPPH·清除活性變化趨勢(shì)不盡相同，還原力在高濃度下?lián)p失較少，而DPPH·清除活性損失率隨樣品濃度增加，變化不顯著(p＜0.05)。芡種殼提取物在堿性條件下極不穩(wěn)定，這是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)在堿性條件下會(huì)快速分解，從而導(dǎo)致其抗氧化性顯著降低［23－24］。

3 結(jié)論

采用乙醇和50%乙醇分步浸提法，分別從芡種殼中得到兩種提取物A和B，其中含有豐富的多酚類物質(zhì)(763.65、517.04mg/g)和一定量的總糖(11.72、12.32mg/g)，總樣品得率超過(guò) 20%。HPLC－UV法分析結(jié)果表明，A和B兩種芡種殼提取物中主要的多酚物質(zhì)組分為:沒(méi)食子酸(314.0、281.4mg/g)、兒茶素類、蘆丁(54.68、44.81mg/g)和少量綠原酸。

表8 堿處理下提取物還原力和DPPH·清除活性損失率(%)Table 8 The antioxidant capacities lose rate of extracts treated with alkali

抗氧化穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，芡種殼提取物對(duì)高壓滅菌條件、紫外線處理和強(qiáng)堿性環(huán)境均非常敏感，尤其是堿性條件下，其抗氧化活性(還原力和DPPH·清除活性)幾乎損失殆盡。在強(qiáng)酸性條件下，其還原力和DPPH·清除活性均會(huì)顯著增加，原因可能是其中一些多酚分子發(fā)生水解，形成抗氧化性更強(qiáng)的物質(zhì)。所以，芡種殼提取物可以考慮添加到一些酸性食品中。

［1］劉玉鵬，劉梅，劉俊英，等.30種中草藥的抗氧化活性研究［J］.煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與工程版，2000，13(1):70－73.

［2］李成良，陳學(xué)好，李良俊，等.芡實(shí)黃酮類物質(zhì)的提取及抗氧化性研究［J］.長(zhǎng)江蔬菜:學(xué)術(shù)版，2010(14):57－61.

［3］Samarjit Das，Peter Der，Utpal Raychaudhuri，et al.The effect of Euryale ferox(makhana)，an herb of aquatic origin，on myocardial ischemic reperfusion injury［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2006，289:55－63.

［4］Jha V，Barat G K，Jha U N.A Nutritional evaluation ofEuryale feroxSalisb(Makhana)［J］.Journal of Food Science and Technology，1991(8):326－328.

［5］張名位，池建偉，孫玲，等.潮州芡實(shí)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999(2):27－29.

［6］Lee S E，Mi J E，Hee K J.Antioxidant activity of extracts fromEuryale feroxseed［J］.Experimental and Molecular Medicine，2002，34:100－106.

［7］Mamta Shankar，Neha Chaudhary，Dheer Singh.A review on gorgon nut［J］.InternationalJournalofPhamaceutical＆Biological Archives，2010(1):101－107.

［8］Puri A，Sahai R，Singh KL.Immunostimulant activity of dry fruits and plants materials used in Indian traditional medical system for mothers after child birth and invalids［J］.Journal Ethnopharmacology，2000，71:89－92.

［9］JhaS N，Suresh Prasad.Determination ofProcessing Conditions for Gorgon Nut(Euryale ferox)［J］.J Agric Engng Res，1996，63:103－112.

［10］鄧宇.表面活性劑在芡實(shí)栲膠提取中作用的初步研究［J］.化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2002，23(2):1－3.

［11］王和才.芡實(shí)種皮總鞣質(zhì)的提取及含量測(cè)定［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(8):224－226.

［12］孫文凱，袁懷波，許衛(wèi)，等.芡實(shí)殼提取物抗氧化能力研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(4):100－102.

［13］張汆，薛連海，賈小麗，等.D101樹脂分離純化芡實(shí)多酚的特性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30(20):260－264.

［14］Chung S Yang，Joshua D Lambert，Shengmin Sang.Antioxidative and anti－carcinogenic activities of tea polyphenols［J］.Arch Toxicol，2009，83:11－21.

［15］Linette Castillo－Pichardo，Michelle M Mart?'nez－ Montemayor E，Joel E Mart?'nez，et al.Inhibition of mammary tumor growth and metastases to bone and liver by dietary grape polyphenols［J］.Clin Exp Metastasis，2009，26:505－516.

［16］Kyoichi Osada，Takashi Suzuki，Yuki Kawakami，et al.Dosedependent hypocholesterolemic actions of dietary apple polyphenol in rats fed cholesterol［J］.Lipids，2006，41:133－139.

［17］張立華，張?jiān)?，安春艷，等.石榴皮提取物的大孔樹脂純化及其抗氧化性能［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009，25(增刊1): 142－147.

［18］Gulcin I，Huyut Z，Elmastas M，et al.Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid［J］.Arabian Journalof Chemistry，2010(3):43－53.

［19］Roussis IG，Lambropoulos I，Tzimas P，et al.Antioxidant activities of some Greek wines and wine phenolic extracts［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2008，21:614－621.

［20］Chatchawan Chotimarkorn，Soottawat Benjakul，Nattiga Silalai.Antioxidant components and properties of five long－grained rice bran extracts from commercial available cultivars in Thailand［J］.Food Chemistry，2008，111，636－641.

［21］Seok Hyum Nam，Sun Phil Choi，Mi Young Kang，et al.Antioxidative activities of bran extracts from twenty one pigmented rice cultivars［J］.Food Chemistry，2006，94:613－620.

［22］Chang W Choi，Sei C Kin，Soon S Hwang，et al.Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between korean medicinal plants and flavonoids by assay－guided comparison［J］.Plant Science，2002，163:1161－1168.

［23］Huang D，Ou B，Prior RL.The chemistry behind antioxidant capacity assays［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2005，53:1841－1856.

［24］Boyer J，Brown D，Liu RH.In vitro digestion and lactase treatment influence uptake of quercetin and quercetin glucoside by the Caco－2 cell monolayer［J］.Nutrition Journal，2005(4):1－8.

Antioxidative stability of extracts fromEuryale feroxseed shell

ZHANG Cuan1，2，XU Xing－lian1，*，ZHOU Guang－h(huán)ong1，LI Chun－bao1，LI Ling1
(1.Key Lab of Meat Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;
2.School of Biology and Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，China)

Two kinds of extracts，A and B，were obtained from Euryale ferox seed shell(EFS)extracted with ethanol and its 50%aqueous solution，respectively.The constituents and major polyphenols compounds in extracts were determined by HPLC－UV method，and the antioxidative stabilities under different environments were also investigated in present article.The results showed that there are highly content total phenol in extracts of A and B，they are 763.65and 517.04mg/g，respectively.The major polyphenols compounds in extracts were gallic acid(314.0 and 281.4mg/g)，catechins，rutin(54.68 and 44.81mg/g)and little of chlorogenic acid.The analysis results of antioxidative stability indicated that two kinds of EFS extracts were very sensitive to the high pressure sterilization，ultraviolet and alkali，especially to the alkali，the total reducing power and DPPH radical scavenging ability of extracts completely lost.Treated with strong acid，the total reducing power and DPPH radical scavenging ability had not lost but significantly enhanced.So，the extracts from euryale ferox seed shell could be used in acidic food materials.

Euryale ferox seedshell(EFS)extracts;antioxidant activity;stability

TS201.2

A

1002－0306(2012)21－0057－05

2012－04－16 *通訊聯(lián)系人

張汆(1970－)，女，副教授，博士，主要從事食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)、膳食蛋白、功能食品方面的研究。

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200903012);江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)基金(BA2009007);安徽省教育廳項(xiàng)目(KJ2012B128)。