李夢(mèng)琳，王亞?wèn)|，林 夢(mèng)，畢福廣，權(quán)春善

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

白色念珠菌(Candida albicans)又稱白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界及正常人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道中，為常見(jiàn)的條件致病性真菌［1］。機(jī)體在菌群失調(diào)、免疫力降低等情況下，轉(zhuǎn)化為致病性念珠菌，引起鵝口瘡、口角炎、陰道炎、肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎、敗血癥等多種疾病。近年來(lái)，白色念珠菌已成為醫(yī)院真菌感染最常見(jiàn)的致病菌之一，尤其是人體免疫缺陷導(dǎo)致的念珠酵母菌感染成為近年來(lái)惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一［2］。因此，加強(qiáng)對(duì)白色念珠菌感染的治理已不容忽視。目前，治療白念珠菌感染的最常用方法就是使用廣譜抗生素，如制霉菌素、酮康唑、克霉唑等，但這些抗生素的使用造成了菌體的極大抗藥性，致使藥物對(duì)白色念珠菌的療效降低或無(wú)效，影響惡性血液病患者的治療效果，甚至可以導(dǎo)致患者死亡［3］。本研究通過(guò)對(duì)構(gòu)樹(shù)果實(shí)酵母菌的分離、篩選及初步鑒定，找到了1株能夠有效抑制白色念珠菌生長(zhǎng)繁殖的拮抗酵母菌，其拮抗效果穩(wěn)定、持久，為治療白色念珠菌感染的腫瘤患者等高危人群的新型藥物開(kāi)發(fā)研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 構(gòu)樹(shù)果實(shí):采自大連民族學(xué)院。白色念珠菌:大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物保藏室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①YEPD液體培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):葡萄糖 0.2%，蛋白胨 0.2%，酵母浸粉0.1%，pH 6.0;②馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，純水 1.0 L，pH自然;③同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):(NH4)2SO40.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉0.02%;④同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):葡萄糖2.0%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.02%，KNO30.78%，對(duì)照組不添加 KNO3而添加(NH4)2SO40.78%;⑤產(chǎn)生類淀粉化合物培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):(NH4)2SO40.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2· 2H2O 0.01%，NaCl 0.01%，葡萄糖3.0%，酵母浸粉 0.1%;⑥糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:干酵母粉6 g，純水1.0 L，pH自然;⑦高滲透壓培養(yǎng)基和麥芽汁液體培養(yǎng)基組成參見(jiàn)文獻(xiàn)［4］。

1.1.3 試劑巰基乙醇、EDTA、K2HPO4、KH2PO4、山梨醇、檸檬酸鈉、蝸牛酶、卡那霉素、Trans8K DNA Marker、RNase A由北京全式金生物技術(shù)公司提供，其他試劑均使用分析純。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)樹(shù)果實(shí)酵母菌的分離 采摘成熟構(gòu)樹(shù)果實(shí)3枚放入無(wú)菌錐形瓶中，常溫保存3 d，加入200 mL已滅菌的0.85%氯化鈉，振搖果實(shí)至溶液渾濁。然后取 1 mL 分別稀釋 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8倍，從稀釋倍數(shù)為10－4開(kāi)始分別取100 μL涂于含卡那霉素的YEPD固體培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)3 d。將形成的不同的菌落進(jìn)行移種，并挑取單菌落，鏡檢，通過(guò)其形態(tài)特征，確定其是酵母菌，進(jìn)行平板劃線純化［5］。

1.2.2 拮抗酵母菌抗菌活性研究 取新培養(yǎng)的白色念珠菌液體培養(yǎng)液稀釋1000倍后，吸取20 μL均勻涂于YEPD固體培養(yǎng)基上［6］，使用打孔器在培養(yǎng)基中間位置打孔，并吸取200 μL新培養(yǎng)的酵母菌培養(yǎng)液于孔內(nèi)，28℃溫箱中培養(yǎng)3 d后觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.3 抗白色念球菌酵母菌的鑒定 ①形態(tài)特征觀察及培養(yǎng)特征［7-9］:a.細(xì)胞形態(tài):將新培養(yǎng)的酵母菌接種于YEPD固體培養(yǎng)基上，置28℃溫箱中培養(yǎng)3 d，用接種環(huán)以無(wú)菌操作法分別挑取菌落少許，制成水浸片，置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，并測(cè)量其大小;b.子囊孢子的形成和形態(tài):在麥芽汁平板上培養(yǎng)3 d后，接種在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)1周，然后顯微觀察是否形成子囊孢子;c.培養(yǎng)特征(群體特征):取新培養(yǎng)酵母，移種于麥芽汁液體中，置28℃溫箱中培養(yǎng)3 d后觀察是否發(fā)酵，培養(yǎng)液清濁程度，是否形成浮膜、環(huán)或島，沉淀物的疏松或緊密等。將酵母菌于YPD固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2 d，用相機(jī)對(duì)生長(zhǎng)出的酵母菌單菌落進(jìn)行拍照;②生理生化測(cè)定:糖發(fā)酵測(cè)試、碳源同化測(cè)試、肌醇同化測(cè)試、耐高滲透壓的測(cè)試和類淀粉化合物的形成試驗(yàn)均按照文獻(xiàn)［10-11］;③酵母菌基因組DNA的提取:將酵母菌接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃、140 r/min的恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)16～18 h，嚴(yán)格控制培養(yǎng)時(shí)間，使酵母菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期［12］。吸5 mL菌液分次加入到1.5 mL離心管中，室溫10000 r/min離心1 min，收集菌體，棄上清。加無(wú)菌水500 μL洗滌菌體，10000 r/min離心1 min，棄上清后，重復(fù)洗滌2次。加500 μL巰基乙醇溶液重懸菌體，37℃水浴處理20 min，期間輕輕顛倒離心管2～3次，10000 r/min離心1 min，棄上清后加入500 μL SCPB緩沖液，懸浮菌體。加過(guò)濾除菌后的200 μL蝸牛酶溶液，37 ℃水浴60 min，13000 r/min 離心2 min，棄上清。加SE緩沖液500 μL洗滌沉淀，并吹打懸浮，10000 r/min離心1 min，棄上清，重復(fù)洗滌5～6次。加500 μL裂解液，65℃水浴30 min。加5 mol/L KAc溶液200 μL，冰浴60 min 后，4 ℃下12000 r/min離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積酚-氯仿-異戊醇，劇烈震蕩，4℃，12000 r/min離心10 min，吸上清至新離心管中，重復(fù)上步一次。加等體積冷異丙醇，－20℃靜置10 min，4 ℃，12000 r/min 離心10 min，棄上清;用70%冷乙醇洗滌沉淀2～3次，室溫晾干沉淀。加TE緩沖液50 μL溶解沉淀后加入5 mg/mL RNase A 2 μL，37 ℃保溫 30 min，自然冷卻后4℃保存［13］;④酵母菌DNA電泳檢測(cè):提取基因組采用瓊脂糖凝膠電泳方法測(cè)定樣品中DNA的濃度和純度，提取基因組樣品5 μL上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，Gel Red染色，100 V電壓電泳約30 min，凝膠成像儀下觀察其條帶;⑤PCR擴(kuò)增18S rDNA片段:采用酵母18S rDNA通用引物擴(kuò)增目標(biāo)片斷。擴(kuò)增正向引物P1序列為5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3';反向引物 P2序列為5'-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3'。引物由上海生物工程公司合成，擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物約為2000 bp。PCR 反應(yīng)體系(50 μL):10 ×PCR 緩沖液 5 μL，dNTP 4 μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，其余用無(wú)菌水補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min［14］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化并電泳檢測(cè)后，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和分析 將測(cè)得的18S rDNA序列用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索，選取同源性較高的序列，用Clustal X 1.81進(jìn)行多序列比對(duì)，利用軟件中的鄰位相接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)次數(shù)設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母菌的篩選結(jié)果及形態(tài)特征

從腐敗構(gòu)樹(shù)果實(shí)樣品中進(jìn)行酵母菌分離純化，得到15株酵母菌，并從中篩選得到1株白色念珠菌的拮抗酵母菌LM-1，其在篩選培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生明顯的抑菌圈(圖1a)。LM-1細(xì)胞呈卵圓形、多邊芽殖，具有不同形態(tài)的芽細(xì)胞(圖1b)，并能進(jìn)行有性生殖，每個(gè)子囊內(nèi)含子囊孢子3～4個(gè)，子囊孢子呈帽形(圖1c)。LM-1菌株在麥芽汁液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，培養(yǎng)液混濁，不形成浮膜、環(huán)和島，錐形瓶底部有較多沉淀，沉淀物緊密;而菌落呈圓形，乳白色，直徑3～4 mm，表面光滑，濕潤(rùn)稍透明，邊緣整齊，與培養(yǎng)基不結(jié)合，單個(gè)分散(圖1d)。

圖1 酵母菌LM-1對(duì)白色念珠菌的抑制作用和形態(tài)特征Fig.1 Antifungal activity and the morphology of the LM-1

2.2 生理和生化鑒定

2.2.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果 菌株LM-1不能利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉子糖進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生CO2，如表1所示。

表1 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of sugar fermentation test

2.2.2 碳源、氮源同化及其他生理生化特性 菌株LM-1不能利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖等6種糖類進(jìn)行發(fā)酵，但能同化這6種糖類和糖類以外的有機(jī)物，如乙醇、可溶性淀粉等。同時(shí)菌株LM-1能同化硝酸鹽和肌醇，但不耐高滲透壓，且可在37℃培養(yǎng)條件下正常生長(zhǎng)、繁殖，如表2所示。

2.2.3 類淀粉化合物形成測(cè)定 通過(guò)向培養(yǎng)液中添加盧戈氏碘液發(fā)現(xiàn)，溶液沒(méi)有顏色變化，表明該酵母菌沒(méi)有合成類淀粉化合物。

2.3 LM-1酵母菌的細(xì)胞形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果

通過(guò)與已經(jīng)鑒定的酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落和細(xì)胞形態(tài)相比［15］，LM-1酵母菌與有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora sp.)、擬 威 克 酵 母 屬 (Wickerhamiella sp.)和油脂酵母屬(Lipomyces sp.)親緣關(guān)系最近。

表2 碳源、氮源同化及其他生理生化特性Table 2 Carbon and Nitrogen assimilation and other physiological and biochemical characteristics of the isolates

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 LM-1基因組DNA質(zhì)量檢測(cè) LM-1基因組DNA樣品的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2所示，提取的基因組條帶整齊明亮，無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明樣品基因組所含雜質(zhì)較少，其質(zhì)量約為50 ng/μL。

2.4.2 LM-1菌株18S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果 PCR擴(kuò)增完成后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖3所示，其基因組擴(kuò)增后所得的目的片段條帶清晰且較亮，片段大小約為2000 bp 左右［16］。

圖4 菌株18S rDNA序列與其他酵母菌親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of LM-1 strain and theirs closest relatives based on 18S rDNA sequence

2.4.3 LM-1酵母菌18S rDNA序列與其他酵母菌親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 對(duì)PCR擴(kuò)增得到的LM-1菌株18S rDNA的序列進(jìn)行了測(cè)定，并將結(jié)果登錄在NCBI GenBank中(登錄號(hào):JX455158)。同源性比對(duì)結(jié)果表明，LM-1菌與有孢漢遜酵母和假絲酵母的同源性都很高，18S rDNA序列相似程度均達(dá)99%。從圖4可知，LM-1菌與Hanseniaspora uvarum的親緣關(guān)系最近。綜合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與上述的形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，最終將LM-1菌鑒定為有孢漢遜酵母屬［17］。

3 討論

白色念珠菌是重要的人體條件致病性病原真菌，是引起很多疾病的主要原因之一，尤其是免疫力低下的病人，如艾滋病人以及某些進(jìn)行過(guò)器官移植的患者，更易成為深度真菌感染的受害者。近年來(lái)，隨著免疫缺陷患者的增多以及新的治療技術(shù)的發(fā)展，臨床上廣譜抗生素、化療藥物和免疫抑制劑大量使用，真菌感染尤其是深部真菌病發(fā)病率逐年增加。自發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗真菌抗生素灰黃霉素以來(lái)，該領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，相繼有很多抗真菌藥物用于臨床，但這些藥物的抗菌作用程度、機(jī)制以及毒性等不盡相同。雖然已開(kāi)發(fā)了眾多的抗真菌藥物對(duì)其進(jìn)行防治，但由于藥物產(chǎn)生的副作用以及近年出現(xiàn)的耐藥性菌株，促使人們不得不尋找其他新型、有效的抗真菌藥物及先導(dǎo)化合物。

本文從構(gòu)樹(shù)果實(shí)中分離拮抗白色念珠菌的酵母菌，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，初步鑒定為有孢漢遜酵母屬。此菌株能夠產(chǎn)生對(duì)白色念珠菌具有拮抗作用的物質(zhì)，影響或限定了病原菌的生存和活動(dòng)。有孢漢遜酵母屬酵母菌大多用于釀酒和食品工業(yè)，還未曾報(bào)道具有抗菌活性的有孢漢遜酵母菌。通過(guò)LM-1菌株的產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)一步分離純化，并研究其抗菌機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的抗菌靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)新型真菌藥物。

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