陳耀國

(上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司，上海201206)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是一種以由骨強(qiáng)度受損導(dǎo)致骨折危險增加為特征的骨骼疾病，是嚴(yán)重影響老年人身體健康的三大疾病之一［1］。1996年，WHO世界骨質(zhì)疏松癥大會上達(dá)成共識，認(rèn)為治療骨質(zhì)疏松癥的理想藥物是甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)。

人甲狀旁腺激素是由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的含84個氨基酸的激素，最初合成產(chǎn)物是含115個氨基酸的前甲狀旁腺素原，在分泌過程中切除N端的31個殘基后，形成成熟的由84個氨基酸組成的單鏈多肽激素。通過受體介導(dǎo)，PTH能夠激活腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等產(chǎn)生cAMP、IP3、Ca2+和二?；视偷劝麅?nèi)二級信使［2］。rhPTH(1－34)是第一種用于臨床的治療骨質(zhì)疏松癥的PTH類似物，它于2002年11月由美國FDA通過，商品名為特立帕肽，主治絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，并于2003年初在美國上市［3］。乳糖無毒性，價格便宜，可在pET系統(tǒng)中用于誘導(dǎo)宿主菌表達(dá)重組產(chǎn)物［4］。本文以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，對乳糖誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料

1.1 菌株 Escherichia coli BL21(DE3)含 pET28a(+)－PTH重組質(zhì)粒，由公司研發(fā)工藝部提供。

1.2 培養(yǎng)基 搖瓶培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基:蛋白胨(10 g·L－1)，酵母粉(5 g·L－1)，NaCl(10 g·L－1);發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基:葡萄糖(5 g·L－1)，蛋白胨(10 g·L－1)，酵母粉(5 g·L－1)，KH2PO4(2 g·L－1)，K2HPO4(4 g·L－1)，Na2HPO4(7 g·L－1)，(NH4)2SO4(1.2 g·L－1)，MgSO4(0.5 g·L－1)，泡敵 0.02%(v/v);補(bǔ)料液:葡萄糖(300 g·L－1)，蛋白胨(50 g·L－1)，酵母粉(50 g·L－1)，MgSO4(3 g·L－1);乳糖誘導(dǎo)液:乳糖(200 g·L－1);全部培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0。

1.3 試劑 蛋白胨、酵母粉(英國Oxoid公司);異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和乳糖(上海生物工程有限公司);SDS，甘氨酸，Tris(Sigma公司);30% 丙烯酰胺－雙丙烯酰胺溶液(美國伯樂公司);卡那霉素(荷蘭Duchefa Biochemie公司);Marker(分子量范圍14 400～97 400，上海升正生物公司)。

1.4 主要設(shè)備 HZQ－X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇太倉市華美生化儀器廠);UV2000分光光度計(jì)(美國尤尼柯公司);Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司);PAC 1000電泳儀(美國伯樂公司);BIOTECH－5BG－4發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司);Gel Doc EZ Imager凝膠成像系統(tǒng) (美國伯樂公司)。

2 方法

2.1 菌體生長及目的蛋白表達(dá)量的測定方法

2.1.1 菌體生長情況以A600確定 將發(fā)酵液稀釋一定的倍數(shù)，測定600 nm波長下的吸光度，使測定值在0.3與0.7之間［5］，A600= 稀釋倍數(shù) × 吸光度。

2.1.2 目的蛋白表達(dá)量的分析 取誘導(dǎo)后的發(fā)酵液12 000 r·min－1離心10 min后去上清，洗滌再離心后，按文獻(xiàn)［5］的方法進(jìn)行SDS－PAGE電泳，丙烯酰胺的濃度為15%;通過凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白占菌體總蛋白的比例。

2.2 乳糖誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白

2.2.1 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化 ①確定乳糖最佳誘導(dǎo)濃度:取甘油菌1‰接種到50 mL(250 mL錐形瓶)含50 mg·L－1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min－1，培養(yǎng)12～15 h進(jìn)行菌種活化。將活化好的菌液以2%的接種量加入到50 mL(250 mL 錐形瓶)LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min－1，培養(yǎng)2～4 h(A600≈1.0)時，分別向9個搖瓶添加終濃度為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5% 和 2.0% 的乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE電泳并用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量;②確定乳糖最佳誘導(dǎo)時間:將活化好的菌液以2%的接種量加入到50 mL(250 mL錐形瓶)LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min－1，培養(yǎng) 2～4 h(A600≈1.0)時，向搖瓶中添加最佳濃度的乳糖，于誘導(dǎo)0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 和 7 h 各取 1 mL 菌液做全菌 SDS －PAGE電泳并用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

2.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化 ①間歇補(bǔ)料培養(yǎng):在5 L發(fā)酵罐加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基3 L，115℃滅菌，接種量6%，通氣量200 L·h－1，通過流加氨水調(diào)節(jié)pH為7.0，溶氧上升到80%后加入100 mL的補(bǔ)料液，待溶氧回升至80%后再次加入100 mL的補(bǔ)料液，如此間歇補(bǔ)料，整個過程保持溶氧不低于30%。A600達(dá)到19～20時，加入100 mL的乳糖誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)0 h、3 h、4 h和5 h各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE電泳并用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量;②分批補(bǔ)料培養(yǎng):在5 L發(fā)酵罐加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基3 L，115℃滅菌，接種量6%，通氣量200 L·h－1，通過流加氨水調(diào)節(jié)pH為7.0，溶氧上升到80%后開始按80 mL·h－1的速度流加補(bǔ)料液，整個過程保持溶氧不低于30%，A600達(dá)到19～20時，加入100 mL的乳糖誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)0 h、3 h、4 h和5 h各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE電泳并用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 乳糖最佳誘導(dǎo)濃度的確定 為確定合適的乳糖誘導(dǎo)濃度，分別以0～20%不同濃度的乳糖誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，在菌體A600達(dá)到1.0時加入乳糖，隨著乳糖濃度的提高，在一定范圍內(nèi)目的蛋白的表達(dá)量也隨之提高，當(dāng)乳糖濃度為0.6%時，目的蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大，占總蛋白的 56.8%。此后隨著乳糖濃度的提高，目的蛋白的表達(dá)量有所減少。同樣，隨著乳糖濃度的提高，誘導(dǎo)4 h后的菌體A600也隨之增加，在乳糖濃度為0.6%時達(dá)到最大值(如表1)，這說明乳糖能促進(jìn)菌體的生長。但乳糖濃度大于0.6%時誘導(dǎo)4 h后的菌體A600開始下降，這可能由于高濃度的乳糖對菌體生長有抑制效應(yīng)。

表1 不同濃度乳糖的誘導(dǎo)結(jié)果

圖1 乳糖濃度的確定

3.2 乳糖最佳誘導(dǎo)時間的確定 在菌體A600達(dá)到1.0時加入0.6%的乳糖，37 ℃，200 r·min－1振蕩培養(yǎng)，在各時間點(diǎn)取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE電泳分析。從圖2電泳結(jié)果可知，加入乳糖后，隨著時間的延長，目的蛋白占總蛋白的比值逐步升高，在4 h時達(dá)到最高(54.6%)，并且雜蛋白表達(dá)量較少，之后目的蛋白逐步減少。

圖2 誘導(dǎo)時間的確定

表2 不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后菌體生長情況

表3 不同誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)結(jié)果

從表2可以看出，相同時間點(diǎn)，加入乳糖比加入IPTG的菌體A600要高得多，說明IPTG可能對菌體生長有毒害效應(yīng);而乳糖對菌體生長有促進(jìn)作用。從表3可以看出，乳糖誘導(dǎo)4h時目的蛋白的比值達(dá)到54.6%，這比最佳誘導(dǎo)條件下IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量要高(1 mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)比值約為47.6%)。

3.3 發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵初期溶氧持續(xù)下降，培養(yǎng)至4～5 h左右，溶氧上升到80%時，表明發(fā)酵罐里的營養(yǎng)物質(zhì)基本耗盡，開始間歇加入補(bǔ)料液(A－間歇補(bǔ)料培養(yǎng))和按80 mL·h－1的速度流加補(bǔ)料液(B－分批補(bǔ)料培養(yǎng))，溶氧迅速下降，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速(500～700 r·min－1)和增加通氣量保持溶氧不低于30%，A600達(dá)到19～20時，加入100 mL的乳糖誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)0 h、3 h、4 h和5 h各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE電泳并用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。兩種培養(yǎng)方式誘導(dǎo)4 h時，目的蛋白比值都達(dá)到最高，間歇補(bǔ)料培養(yǎng)方式的目的蛋白的比值僅有30.1%，而分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式的目的蛋白比值達(dá)到了42.6%，可能間歇補(bǔ)料時一次性加入的葡萄糖過多，影響了乳糖的誘導(dǎo)效果。

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)比較

4 討論

本文以乳糖作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)rhPTH(1－34)，當(dāng)乳糖濃度為0.6%、誘導(dǎo)時間4 h時，乳糖誘導(dǎo)效果好于IPTG。當(dāng)乳糖濃度為0.6%時，目的蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大，乳糖濃度增高反而抑制了目的蛋白的表達(dá)，這可能是由于乳糖從胞外轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)需要β－半乳糖苷透過酶的作用，這是一種主動運(yùn)輸?shù)倪^程，高濃度的乳糖會造成菌體質(zhì)子推動力的消耗，從而“分散”了菌體的能量［6］。此外，本文對5 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)工藝進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示連續(xù)分批補(bǔ)料培養(yǎng)效果好于間歇補(bǔ)料方式。

［1］劉豐亮，常宏，劉潔，等.重組人甲狀旁腺素的原核表達(dá)及發(fā)酵條件初步優(yōu)化［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，30(2):198 －201.

［2］Potts JT，Kronenberg HM，Rosenblatt M.Parathyroid hormone:Chemistry，biosynthesis and mode of action［J］.Adv Protein Chem，1982，35:323 －396.

［3］張梅，鄔敏辰，金堅(jiān).PTH融合蛋白研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009，20(3):25 －28.

［4］吳一凡，張雙全，高秀玉，等.乳糖誘導(dǎo)pET載體表達(dá)重組蛋白的研究［J］.南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，25(1):89 －93.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(三部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅡA，ⅣC.

［6］張毅，屈賢銘，楊勝利.乳糖作為誘導(dǎo)劑對重組目的蛋白表達(dá)的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(4):464－468.