南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院（4200）黃明菊 李卓

中南大學(xué)（410013）周應(yīng)軍2

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai.的干燥全株，分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南各省。腫節(jié)風(fēng)具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，臨床上主要用于治療惡性腫瘤、感染性疾病、口腔疾病、跌打損傷等癥[1][2][3][4]。我們的前期研究已從腫節(jié)風(fēng)藥材的水提取液中分離并鑒定了23個(gè)單體成分，同時(shí)對(duì)腫節(jié)風(fēng)抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，腫節(jié)風(fēng)多酚類(lèi)部位具有很強(qiáng)的抗氧化活性，而且由此部位分離得到的多種化學(xué)成分也具有很強(qiáng)的抗氧化活性[5][6][7][8][9]。

為進(jìn)一步分析研究腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分組成及抗氧化活性，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)腫節(jié)風(fēng)多酚類(lèi)部位進(jìn)行了分析，通過(guò)與對(duì)照化合物比較（保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D譜），標(biāo)定了HPLC圖譜上的14個(gè)主要的色譜峰，分析了7個(gè)不同省份腫節(jié)風(fēng)藥材的HPLC色譜圖，試驗(yàn)結(jié)果表明，各省份藥材的成分組成基本相同，成份組成主要有3種類(lèi)型：咖啡酸衍生物、黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)，但圖譜上各主要色譜峰的峰面積差異較大。不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材均有抗氧化活性，但不同產(chǎn)地活性大小差異較大。HPLC圖譜總峰面積與抗氧化活性大小基本一致?，F(xiàn)將我們的研究分析報(bào)告如下，以便為相關(guān)技術(shù)人員對(duì)腫節(jié)風(fēng)藥材的質(zhì)量控制與開(kāi)發(fā)利用提供一個(gè)參考依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵，在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站；BP210S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司），Elx-800型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

1.2 試劑與藥材 乙腈為色譜純（TEDIA company），水為市售純凈水，丙酮（湖南師大化學(xué)試劑廠）、磷酸（汕頭市光華化學(xué)廠）、碳酸氫鈉（天津市巴斯夫化工廠）均為分析純，聚酰胺（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）。DPPH?（二苯代苦味?；杂苫┵?gòu)于SIGMA公司；95%乙醇（分析純，購(gòu)自天津博迪試劑公司）。對(duì)照化合物（經(jīng)HPLC檢測(cè)純度均大于90%），均為從腫節(jié)風(fēng)中分離所得，并通過(guò)化學(xué)與波譜手段鑒定其結(jié)構(gòu)。腫節(jié)風(fēng)藥材7批，均從各產(chǎn)地購(gòu)買(mǎi)。

2 方法

2.1 腫節(jié)風(fēng)多酚類(lèi)部位儲(chǔ)備液的制備 精密稱取腫節(jié)風(fēng)藥材10.0g，加水250mL煎煮1小時(shí)后，加水補(bǔ)足失重，過(guò)濾，取續(xù)濾液200mL，并將其減壓濃縮至小體積，加水補(bǔ)足至20mL，加入丙酮60mL，搖勻，放置過(guò)夜。取上清液60mL，濃縮干，加水5mL使其溶解，通過(guò)已處理好的聚酰胺柱（30～60目，水裝柱，25mL），水洗脫2BV，棄去水洗脫液，0.5%碳酸氫鈉溶液洗脫5BV，收集洗脫液，用鹽酸調(diào)pH=5～6，蒸干，殘?jiān)?0mL水溶解，作為儲(chǔ)備液。

2.2 腫節(jié)風(fēng)多分類(lèi)部位指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液的制備

2.2.1.1 對(duì)照品溶液 稱取各對(duì)照品化合物適量，用50%甲醇配成約為0.5mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液 取腫節(jié)風(fēng)多酚類(lèi)部位儲(chǔ)備液經(jīng)45μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液待用。

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.2.1 流動(dòng)相的確定 參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，確定流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈-磷酸-水，采用梯度洗脫，A相為乙腈，B相為0.1%的磷酸水溶液，經(jīng)比較多種梯度條件，最后確定梯度程序?yàn)椋?～5min，5% A線性梯度至7.5% A；5～13min，線性梯度至10.0% A；13～25min，線性梯度至15% A；25～30min，線性梯度至17.5% A；30～40min，線性梯度保持17.5% A；40～45min，線性梯度至20%A；45～50min，線性梯度保持20% A；50～55min，線性梯度至80% A。在此條件下，各色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中。

2.2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)和流速的確定 采用二極管陣列檢測(cè)器，得到在190～400nm各波長(zhǎng)下的色譜圖，最后選定310nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，并記錄190～400nm范圍內(nèi)的紫外吸收?qǐng)D。在310nm波長(zhǎng)下，各共有色譜峰分離情況良好，且均有較大的吸收峰值。對(duì)0.5，0.7，1.0mL/min進(jìn)行了考察，1.0mL/min條件下色譜峰的峰形與保留時(shí)間較好。

2.2.3 方法學(xué)考察

附圖 各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)的HPLC圖譜（A、B）

附圖A 腫節(jié)風(fēng)藥材提取液（產(chǎn)地：湖南）

附圖B 對(duì)照品混合液

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 取湖南藥材（批號(hào)：2006033008）制備供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10μL，記錄各共有主要峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示，各

共有主要峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密度試驗(yàn)下供試品溶液分別在0、6、12、18、24、48小時(shí)進(jìn)樣分析，并同時(shí)記錄各共有主要峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示，各共有主要峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批湖南藥材（批號(hào)：2006033008）樣品5份，制備供試品溶液，在上述色譜條件下分析，并同時(shí)記錄各共有主要峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示，各共有主要峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.4 樣品測(cè)定 按確定的色譜條件和測(cè)定方法，分別對(duì)7個(gè)供試品進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)記錄各樣品的色譜圖和紫外吸收?qǐng)D；在相同的色譜條件下，記錄各對(duì)照化合物混合樣品的色譜圖和紫外吸收?qǐng)D。

附表1 各樣品HPLC色譜圖主要成份峰面積及總峰面積

附表2 不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材對(duì)DPPH自由基清除率及IC50

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 供試品溶液的制備

2.3.1.1 樣品溶液 取儲(chǔ)備液1mL，分別用95%乙醇稀釋至相應(yīng)的濃度梯度（相當(dāng)于藥材6，2，0.6，0.2，0.06mg/mL）的樣品5份。

2.3.1.2 DPPH溶液 稱取DPPH適量，用95%乙醇配成2×10-4mol/L的溶液。

2.3.2 DPPH?自由基清除率的測(cè)定 分別量取上述供試品溶液與DPPH?溶液各100μL于96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，在搖床上震搖2min，避光反應(yīng)28min后用酶聯(lián)免疫儀在517nm下用95%乙醇調(diào)零測(cè)定吸光值。重復(fù)試驗(yàn)3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材的HPLC圖譜分析。色譜峰的歸屬：1：3，4-二羥基苯甲酸；2：結(jié)構(gòu)待定；3：綠原酸；4：咖啡酸-4-O-奎寧酸；5：咖啡酸；6：丁香酸；7：咖啡酸-4-O-奎寧酸甲酯；8：咖啡酸-3-O-奎寧酸甲酯；9：異秦皮啶；10：新落新婦苷；11：槲皮素-3-Oα-D-葡萄糖醛酸；12：迷迭香酸-4-Oβ-D-葡萄糖；13：山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸；14：迷迭香酸。

對(duì)比對(duì)照化合物色譜圖與各樣品HPLC圖譜上相應(yīng)色譜峰中的保留時(shí)間和UV圖譜標(biāo)定了的指紋圖譜上的14個(gè)特征色譜峰（見(jiàn)附圖A、B）。比較各產(chǎn)地藥材的HPLC圖譜，結(jié)果顯示，各樣品的HPLC圖譜顯示出，各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材在整體上來(lái)說(shuō)較為相似，主要的色譜峰組成基本一致，成分主要有3類(lèi)，分別為咖啡酸衍生物、黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)。

HPLC圖譜提示不同產(chǎn)地的藥材在化學(xué)成分上存在的差異：①峰面積總和差異：各樣品HPLC圖譜的總峰面積大小差異顯著，其中，鋒面積最大的廣西藥材是鋒面積最小的貴州藥材的4.15倍（見(jiàn)附表1）。②特征峰差異：廣東產(chǎn)藥材新落新婦苷（峰10）的色譜峰較明顯，而其他產(chǎn)地藥材的HPLC圖譜中，新落新婦苷的色譜峰很微弱或者根本檢測(cè)不到。廣西產(chǎn)腫節(jié)風(fēng)藥材中迷迭香酸（峰14）的峰面積明顯較其他產(chǎn)地的藥材高，是其他產(chǎn)地藥材的3.0～11.3倍。

3.2 腫節(jié)風(fēng)多酚類(lèi)部位的抗氧化活性 不同濃度的腫節(jié)風(fēng)藥材提取液清除DPPH自由基的能力見(jiàn)附表2。由附表2可以看出，腫節(jié)風(fēng)藥材具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，在0.03～3mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著提取物濃度的增加，腫節(jié)風(fēng)藥材對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。

由附表2可知，各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材均顯示了較好的抗氧化活性，但不同產(chǎn)地的藥材抗氧化活性存在有較大的差異。由于各產(chǎn)地的藥材處理方法一致，而且各藥材多酚類(lèi)成分的組成基本相同，因此，各樣品的總峰面積可以粗略反映出其中多酚類(lèi)含量的相對(duì)高低，結(jié)合附表1可發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)總多酚類(lèi)化合物總峰面積的大小與其抗氧化活性強(qiáng)弱基本一致，總峰面積較大的樣品抗氧化活性也較強(qiáng)。

本次研究表明，7個(gè)不同省份腫節(jié)風(fēng)藥材多酚類(lèi)化合物的成分組成基本相同，成份組成主要有3種類(lèi)型：咖啡酸衍生物、黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)，但色譜圖譜上各主要色譜峰的峰面積差異較大。不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)藥材均有抗氧活性，HPLC圖譜總峰面積與抗氧化活性大小基本一致，但不同產(chǎn)地活性大小差異較大，產(chǎn)生的這一差異可能是由于各產(chǎn)地藥材天然生長(zhǎng)環(huán)境、加工及儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)的不確定性，導(dǎo)致各產(chǎn)地藥材的化學(xué)成分和生物活性差異較大。因此，為避免上述可能的影響因素，建議對(duì)腫節(jié)風(fēng)進(jìn)行人工栽培種植，并固定加工儲(chǔ)存條件以穩(wěn)定原藥材的質(zhì)量；企業(yè)在采購(gòu)原藥材時(shí)應(yīng)根據(jù)需要選擇合適產(chǎn)地的原料，固定產(chǎn)地，并對(duì)其指紋圖譜加以考察控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。

綜上所述，各企業(yè)在選擇藥材時(shí)，一定要針對(duì)企業(yè)本身具體的需要、各藥材本身的品質(zhì)及有效成分的活性、各不同產(chǎn)地藥材的色譜圖比較情況等要素，謹(jǐn)慎地選擇適合自己企業(yè)需要的產(chǎn)地的藥材。