賀永明 （遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 熊岳 115009）

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一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

賀永明 （遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 熊岳 115009）

采用正交試驗(yàn)對1株枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。確定了最佳的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖25g/L，豆粕粉60g/L，玉米漿8g/L，在接種量為2%的情況下，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間24h，所獲得活菌數(shù)約為5.3×109CFU/mL。

枯草芽孢桿菌 發(fā)酵培養(yǎng)基 優(yōu)化

微生態(tài)制劑成為抗生素較為理想的替代品[1]。芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑使用的微生物，是國際公認(rèn)可在飼料中直接使用的微生物菌種[2]。由于其具有耐酸、耐高溫和耐高壓，是一類好氧微生物，通過生物奪氧，降低氧化還原電勢，有利于厭氧微生物的生長，從而保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡，而且，芽孢桿菌在腸道中能產(chǎn)生多種消化酶和有機(jī)酸，提高飼料的利用率，抑制有害菌的繁殖、保證宿主健康[2-4]。因而其研究和應(yīng)用受到廣泛重視。

芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)芽孢桿菌制劑的前提。發(fā)酵培養(yǎng)基配方是影響微生物發(fā)酵的重要因素之一[4-6]。本文以一株枯草芽孢桿菌為研究對象，通過對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果為芽孢桿菌制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，購買于中國科學(xué)院微生物研究所，菌種編號8306。

1.1.2 儀器 恒溫振蕩器搖床、pH-211酸度計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋、高速萬能粉碎機(jī)、無菌超凈臺、電子天平。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：牛肉膏3g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5g，定容至1000ml，pH7.0，0.1MPa滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：本試驗(yàn)以葡萄糖、豆餅粉、玉米漿作為碳源和氮源，選用3因素3水平按正交設(shè)計(jì)表L9(33)安排試驗(yàn)(表1)。500ml搖瓶裝液量100ml，pH值7.0，0.1MPa滅菌20min。每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，共27個(gè)培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將枯草芽孢桿菌從保存的斜面轉(zhuǎn)接于新鮮試管斜面，于37℃培養(yǎng)24h。

1.2.2 種子液的制備 取培養(yǎng)好的斜面菌種再接種于盛有100ml無菌種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置搖床37℃振蕩培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速為160r/min。

1.2.3 藥瓶培養(yǎng) 分別取2mL種子液，接入盛有100mL無菌液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中(接種量為2%V/V)。置搖床中，37℃震蕩培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)結(jié)束后測定活菌數(shù)(CFU/ml)。每個(gè)培養(yǎng)基做3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù)的測定 采用傾注倒平板法：采用無菌水作一系列稀釋，每一稀釋度作3個(gè)平皿，37℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS10.0對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析[7]。

2 結(jié)果與分析

由表3的方差結(jié)果可知，3因素對枯草芽孢桿菌發(fā)酵影響的顯著性依次為：葡萄糖>玉米漿>豆餅粉，即葡萄糖對菌體的增殖的影響顯著(P<0.05)，玉米漿次之，豆餅粉影響最小(P>0.05)。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.1(2,2)=9.0

以培養(yǎng)基結(jié)束時(shí)的活菌數(shù)(CFU/mL)作為考察指標(biāo)，從表2可知，試驗(yàn)條件下優(yōu)化水平的最佳的組合是A3B2C3，即葡萄糖濃度是25g/L，豆餅粉濃度為60g/L，玉米漿濃度是8g/L。在接種量為2%的情況下，當(dāng)采用此種配比的發(fā)酵培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h后，活菌數(shù)目可達(dá)5.3×109CFU/ml。

3 討論

本試驗(yàn)研究了營養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌菌數(shù)的影響。在不同營養(yǎng)條件的研究中，證明了該菌株的生長較適應(yīng)速效碳源葡萄糖，但長效氮源豆餅粉對該菌株的生長影響較少。秦艷等[4]在枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化研究中，證明葡萄糖和酵母浸出物對菌數(shù)的提高作用顯著。劉輝等[8]在一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，豆粕液是影響芽孢桿菌菌數(shù)生長的較為顯著的因素。本試驗(yàn)出現(xiàn)不同的結(jié)論可能芽孢桿菌能很好地利用酵母浸出物，與酵母浸出物富含氨基酸、維生素和未知生長因子有關(guān)；另外，不同的菌株，不同的營養(yǎng)配方，在一定范圍內(nèi)也會影響菌數(shù)的生長。玉米漿中富含氨基酸、生物素、維生素和微量元素等，是微生物生長或代謝產(chǎn)物合成的促進(jìn)劑，也會影響到芽孢桿菌菌數(shù)的生長，這與谷春濤等[6]的研究一致。

微生態(tài)制劑的推廣及其使用效果，一定程度上因成本過高和產(chǎn)品的質(zhì)量而受到影響。因此，在微生態(tài)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)中，降低培養(yǎng)基的成產(chǎn)成本，提高單位體積培養(yǎng)液中的菌體數(shù)目至關(guān)重要。本文僅對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的條件進(jìn)行了初步研究，該結(jié)果對枯草芽孢桿菌在發(fā)酵罐的生產(chǎn)工藝上提供了重要的參考數(shù)據(jù)，對后續(xù)的工業(yè)發(fā)酵有重要意義。

[1] 朱馨蕾. 動物微生態(tài)制劑的研究進(jìn)展及存在問題[J]. 山東畜牧獸醫(yī). 2008,8: 9-11.

[2] 熊峰, 王曉霞, 余雄. 芽孢桿菌作為微生物飼料添加劑的生理功能研究進(jìn)展[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007,22(1): 76-79.

[3] 張保全, 朱年華. 芽孢桿菌在畜牧業(yè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 江西畜牧獸醫(yī)雜志, 2007,1: 2-3.

[4] 秦艷, 李衛(wèi)芬, 黃秦. 枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 飼料研究, 2007, 12: 70-74.

[5] 李超, 孫冬巖. 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 飼料研究, 2009, 10: 55-56.

[6] 谷春濤, 彭愛銘, 薩仁娜等. 地衣芽胞桿菌TS-01發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 飼料工業(yè), 2003,24(8): 19-20.

[7] 周德慶. 微生物學(xué)試驗(yàn)教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006.

[8] 劉輝, 魏祥法, 井慶川等. 一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007,1: 100-101.

（2012–03–03）

S852.61+6

A

1007-1733(2012)05-0014-02